高偉娜 唐 瀟 咼 月 王麗君 張明敏 黃光英

華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院中西醫(yī)結合研究所，武漢 430030

近些年來，大量研究［1－2］顯示趨化因子在排卵、月經(jīng)、胚胎著床、分娩等生理過程和早產(chǎn)、HIV感染、子宮內(nèi)膜異位癥、卵巢過度刺激癥等病理過程中均發(fā)揮重要的作用。妊娠期間，母胎界面的趨化因子通過與其受體結合，能夠調(diào)節(jié)白細胞的募集，促進滋養(yǎng)細胞的侵襲，調(diào)整細胞的增殖和黏附分子的表達，從而成為成功妊娠的重要決定者。其中，趨化因子配體／趨化因子受體（CCL2／CCR2）這對配／受體在上述過程中起到關鍵的作用［3－5］。我們前期的研究［6］也證明針刺能夠提高胚泡著床障礙大鼠的著床胚泡數(shù)和妊娠率，能夠調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜Th1和Th2細胞因子的表達。那么，針刺能否調(diào)節(jié)CCR2在母胎界面上的表達呢？通過本研究，將回答這個問題。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

SPF級成年未孕產(chǎn)雌性 Wistar大鼠（鼠齡10～12周，平均體重為220～230 g）和有生育能力的成年雄性Wistar大鼠（平均體重為250～300 g）均來源于湖北省疾病控制中心。所有大鼠均飼養(yǎng)于華中科技大學同濟醫(yī)學院實驗動物中心屏障系統(tǒng)。適應性喂養(yǎng)1周，然后陰道涂片觀察所有大鼠動情周期，動情周期正常者開始進入正常實驗周期。處于動情期的雌性大鼠與雄性大鼠以2∶1的比例于6：00 p m時進行交配，次日8：00 am時行大鼠陰道涂片發(fā)現(xiàn)有大量精子者視為妊娠第1天。然后將懷孕的大鼠隨機分為正常組（N）、胚胎著床障礙組（M）、針刺治療組（A）、黃體酮治療組（W），每組18只，每組孕鼠根據(jù)處死的時間再分為第6天組（D6）、第8天組（D8）、第10天組（D10）。

1.2 試劑與儀器

米非司酮片（夕韻，湖北葛店人福藥業(yè)）、黃體酮注射液（浙江仙琚制藥股份有限公司）由華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院提供。兔抗大鼠多克隆抗體CCR2（ab32144）購于Abcam公司。HRP（辣根過氧化物酶）標記的山羊抗兔Ig G、山羊或兔抗大鼠Actin多克隆抗體購于Santa Cr uz公司。HRP標記的山羊抗兔Ig G（H＋L）和DAB顯色試劑盒購于北京中杉金橋生物技術有限公司。RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒、超敏ECL化學發(fā)光試劑盒購于碧云天生物科技研究所。Cocktail蛋白酶抑制劑購于Roche公司。NC膜來自Pierce公司。Trizol RNA提取試劑盒、逆轉錄試劑盒和SYBR熒光定量試劑盒來源于Takara公司。主要設備：核酸蛋白質(zhì)分析儀（DU730，Beck man Coulter，USA）；PCR 儀（Eppendorf Company，Ger many）；熒光定量PCR儀（Applied Biosystems，Calif or nia，USA）；全能酶標儀（Bio Tek Syner gy2，Ver mote，USA）；尼康顯微成像系統(tǒng)（TE2000－U，Japan）。

1.3 造模與處理

在超凈工作臺中將米非司酮研磨成粉末后溶于適量體積的麻油中，配制成2 mg／ml的米非司酮麻油溶液，分裝后置于4℃冰箱中備用。M組、A組和 W組孕鼠于妊娠第1天9：00 am于頭頸部皮下注射米非司酮麻油溶液（5.5 mg／kg），N組則給予同量的純麻油溶液。從妊娠第1天直至處死當日，A組孕鼠于每日3：00 p m用自制布袋固定后，針刺后三里和三陰交，每5 min行針1次，共留針25 min，穴位的定位和進針深度參考前期的研究［6］；同時 M組和N組大鼠僅固定不予針刺；W組大鼠則每日肌肉注射黃體酮（40 mg／kg）。

1.4 取材

各組孕鼠在1%的戊巴比妥納麻醉下行剖腹，觀察胚泡著床情況。1／3的著床點子宮被收集，立即固定在4%的多聚甲醛中，24 h后行石蠟包埋。剩余的子宮組織置于－80℃冰箱保存。

1.5 妊娠大鼠著床點子宮內(nèi)膜CCR2的蛋白檢測

1.5.1 免疫組織化學法 5μm的石蠟切片置于60℃烤箱中烤片1 h。然后二甲苯中脫蠟，梯度酒精（70%乙醇）中水化。PBS漂洗切片后，切片置于0.01 M的枸櫞酸緩沖液（p H 6.0）中微波修復15 min（98℃）。自然冷卻后，用3%的H2O2室溫下封閉過氧化氫酶10 min。漂洗切片后，5%BSA室溫下封閉20 min。甩干液體，合適濃度的一抗（CCR2 1∶500）4℃孵育過夜。第2天漂洗切片后，根據(jù)一抗來源選擇HRP標記的山羊抗兔Ig G（H＋L）37℃孵育30 min。漂洗切片后，DAB試劑盒顯色，蘇木精復染細胞核，氨水返藍。然后梯度酒精脫水（70%乙醇），二甲苯透明，中性樹膠封片。顯微成像系統(tǒng)拍照后，每張切片選取3個視野用Image－Pro Plus 6.0軟件測得平均光密度值。

1.5.2 Wester n blot法 沿著子宮的系膜對側將子宮沿長軸剪開，在解剖顯微鏡下將胎兒剔除，收集著床點子宮內(nèi)膜。子宮內(nèi)膜被剪碎后放于預冷的RIPA裂解液中在冰上研磨成勻漿狀。冰上靜置30 min。然后4℃，12 000 g離心20 min。上清被收集分裝放于－80℃冰箱中。蛋白濃度用BCA試劑盒定量，酶標儀分析。將加了上樣緩沖液的蛋白98℃蒸煮10 min后，加入12%SDS－PAGE中電泳，然后將分離的蛋白轉移至NC膜上。5%的脫脂牛奶室溫下封閉2 h后，一抗4℃孵育過夜（β－actin 1∶200；CCR2 1∶500）。漂洗后，HRP（辣根過氧化物酶）標記的山羊抗兔Ig G（1∶20 000）室溫下孵育1 h。然后根據(jù)說明書進行ECL曝光。掃描膠片，用Quantity One軟件獲得積分光密度值。每個樣本的光密度值以目的蛋白／β－actin的比值來表示。

1.6 妊娠大鼠著床點子宮內(nèi)膜CCR2的mRNA檢測（Real－ti me PCR）

按照說明書，將剪碎的著床點子宮內(nèi)膜置于預冷的Trizol中提取RNA。取2μl RNA用核酸蛋白質(zhì)分析儀測定其濃度和純度后，用Pri me Script RT Reagent Kit將其逆轉錄成c DNA，反應條件為：37℃15 min，85℃5 s，4℃穩(wěn)定儲存在－20℃冰箱中。然后在20μl體系下進行擴增［10μl SYBR Premix Ex Taq（2×），2μl c DNA樣品，10μM 的引物各0.4μl（引物序列詳見表1），0.4μl ROX Reference Dye（50×），6.8μl無菌DECP水］，反應條件為：第一步95℃30 s，1個循環(huán)；第二步95℃5 s，60℃30 s，40個循環(huán)；第三步95℃15 s，60℃1 min，95℃15 s，1個循環(huán)。其中每個樣本做2個復孔，β－actin為內(nèi)參。每個標本的相對RNA含量通過2－△△ct計算得到。

1.7 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 15.0統(tǒng)計軟件進行分析。所有的實驗數(shù)據(jù)以±s表示，單因素方差分析進行統(tǒng)計處理（如果數(shù)據(jù)滿足方差齊性條件選擇LSD檢驗，如果不滿足，則用Dunnett’s T3檢驗），以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

圖1 各組大鼠妊娠第6、8、10天著床點子宮內(nèi)膜CCR2的蛋白定位

表1 CCR2和β－actin的引物序列

2 結果

2.1 各組妊娠大鼠著床點子宮內(nèi)膜CCR2的免疫組織化學分析

CCR2蛋白的表達在妊娠第6天主要集中在子宮內(nèi)膜的腺上皮和腔上皮，而妊娠第8天和第10天則主要分布在蛻膜細胞上。平均光密度分析結果顯示：與正常組相比，模型組大鼠妊娠第6、8、10天CCR2蛋白的表達均明顯下降（P＜0.05）；而與模型組相比，針刺組和黃體酮組大鼠妊娠第6、8、10天CCR2蛋白的表達則明顯升高（P＜0.05）；針刺組和黃體酮組之間CCR2的表達無差異（P＞0.05）。見圖1－2。

圖2 各組大鼠妊娠第6、8、10天著床點子宮內(nèi)膜CCR2蛋白表達的比較（免疫組織化學法）

2.2 各組妊娠大鼠著床點子宮內(nèi)膜CCR2的Western blot分析

與正常組相比，模型組大鼠妊娠第6、8、10天子宮內(nèi)膜CCR2的蛋白表達明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與模型組相比，針刺組大鼠妊娠第6、10天子宮內(nèi)膜CCR2的蛋白表達和黃體酮組大鼠妊娠第6、8、10天子宮內(nèi)膜CCR2的蛋白表達均明顯上升（P＜0.05）；針刺組和黃體酮組之間CCR2的表達無差異（P＞0.05）。見圖3a－b。

圖3 各組大鼠妊娠第6、8、10天著床點子宮內(nèi)膜CCR2的蛋白表達（Wester n blot）

2.3 各組妊娠大鼠著床點子宮內(nèi)膜CCR2的mRNA表達分析

與正常組相比，模型組大鼠著床點子宮內(nèi)膜CCR2 mRNA的表達在第6、8、10天均明顯下降（P＜0.05）；而針刺組和黃體酮組大鼠妊娠第6、8天子宮內(nèi)膜CCR2 mRNA的表達明顯高于模型組（P＜0.05）；針刺組和黃體酮組之間CCR2的表達無差異（P＞0.05）。見圖4。

圖4 各組大鼠妊娠第6、8、10天著床點子宮內(nèi)膜CCR2 mRNA 表達（Real－time PCR）

3 討論

趨化因子是一類由70～90個氨基酸（8～12 kd）組成的具有趨化特定白細胞亞群的細胞因子超家族。根據(jù)他們的半胱氨酸殘基的相對位置，趨化因子主要被分為4個亞家族：CC、CXC、C、CX3C。趨化因子受體是G蛋白耦聯(lián)細胞表面受體，其命名依據(jù)配體結構而定（CCR、CXCR、CR、CX3CR）。趨化因子不僅能夠趨化特定的白細胞至特定的組織區(qū)域，同時還是白細胞活化的重要調(diào)節(jié)者［7］。趨化因子與特定白細胞亞型的受體結合后，通過上調(diào)黏附分子增強白細胞與內(nèi)皮組織的黏附，促進白細胞的溢出。大量研究顯示趨化因子在妊娠建立過程中有重要作用。CCL2／MCP－1，屬于趨化因子CC（C指半胱氨酸殘基）亞家族，可由炎癥因子刺激的單核－巨噬細胞、成纖維細胞、內(nèi)皮細胞、B細胞和平滑肌細胞等產(chǎn)生。子宮內(nèi)膜產(chǎn)生的CCL2與其特異性受體CCR2結合，能夠特異地趨化巨噬細胞和自然殺傷細胞至母胎界面，并使之激活，產(chǎn)生大量的諸如 LIF、IL－6、IFN－γ等細胞因子，從而有利于胚胎的著床和螺旋動脈的重塑［8－10］。可是，趨化因子CCL2在母胎界面的免疫調(diào)節(jié)作用并非如此簡單。有研究［11－12］指出，在容受期的子宮內(nèi)膜上皮有CCL2和CCR2的存在，他們可能在胚胎的定位和黏附階段起到重要作用。妊娠早期侵襲性細胞滋養(yǎng)層中也發(fā)現(xiàn)CCR2的存在，這些滋養(yǎng)層細胞可能時刻準備著對母胎界面的趨化因子信號做出反應［13］。這說明子宮內(nèi)膜局部的CCL2通過與其受體CCR2的結合，能夠以自分泌和（或）旁分泌的方式調(diào)節(jié)妊娠的進行。

本研究中，我們觀察到CCR2在子宮內(nèi)膜的腔上皮、腺上皮、蛻膜細胞和胚胎上均有表達。由于未進行CCR2和巨噬細胞或自然殺傷細胞的雙重染色，所以CCR2在免疫細胞上的表達情況尚不清楚。胚胎著床障礙組大鼠妊娠第6、8、10天子宮內(nèi)膜CCR2的表達明顯低于正常組，而針刺治療能明顯上調(diào)CCR2在胚胎著床障礙大鼠子宮內(nèi)膜上的表達，且與黃體酮治療的在上調(diào)CCR2表達上的作用無明顯差異。大鼠的胚胎著床發(fā)生在交配后的6～7 d［8］，血管重塑在妊娠8.5 d開始，妊娠10.5 d完成，自此胎盤循環(huán)建立［14］。這說明針刺上調(diào)了CCR2在大鼠子宮內(nèi)膜上的表達，使CCL2／CCR2這對受／配體更加有效的結合，從而有利于胚胎著床和母體螺旋動脈的重塑。另外，有研究顯示，懷孕相關的雌激素、孕激素和人體絨膜促性腺激素能夠上調(diào)CCL2和其對應的受體CCR2的表達，參與蛻膜基質(zhì)細胞功能的調(diào)節(jié)［5］，且本研究中針刺治療與黃體酮治療均能提高CCR2在子宮內(nèi)膜的表達，所以我們推測針刺可能并非直接上調(diào)CCR2在子宮內(nèi)膜上的表達，而是在孕激素的介導下完成的。

總之，針刺能上調(diào)母胎界面CCR2的表達，從而有助于胚胎著床障礙大鼠的胚胎著床和胎盤形成，這為針刺治療不孕癥提供了新的實驗依據(jù)。

［1］COCCHI F，De VICO，AL，GARZINO－DEMO A，et al.I－dentification of RANTES，MIP－1 alpha，and MIP－1 beta as the major HIV－suppressive factors pro－duced by CD 8＋ T cells［J］.Science，1995，270（5243）：1811－1815.

［2］SI MóN C，CABALLERO－CAMPO P，GARCIA－VELASCO JA，et al.Potential i mplications of chemokines in reproductive function：an attractive idea［J］.J Reprod Immunol，1998，38（2）：169－193.

［3］DI MITRIADIS E.Cytokines，chemokines and growth factors in endometrium related to implantation［J］.Human Reproduction Update，2005，11（6）：613－630.

［4］ARICI A，MACDONALD P，CASEY M.Regulation of mon－ocyte chemotactic protein－1 gene expression in human endometrial cells in cultures［J］.Mol Cell Endocrinol，1995，107（2）：189－197.

［5］HE YY，DU MR，GUO PF，et al.Regulation of C－C motif chemokine ligand 2 and its receptor in human decidual stromal cells by pregnancy－associated hor mones in early gestation［J］.Hum Reprod，2007，22（10）：2733－2742.

［6］GUI J，XIONG F，LI J，et al.Effects of acupuncture on Th1，Th2 cytokines in rats of implantation failure［J］.Evid Based Co mplement Atter nat Med，2012，2012：893023.doi：10.1155／2012／893023.

［7］PAPADAKIS K，PREHN J，NELSON V，et al.The role of thymus－expressed chemokine and its receptor CCR9 on lymphocytes in the regional specialization of the mucosal immune system［J］.J Immunol，2000，165（9）：5069－5076.

［8］van MOURIK MS，MACKLON NS，HEIJNEN CJ.Embr yonic i mplantation：cytokines，adhesion molecules，and i mmune cells in establishing animplantation environment［J］.J Leukoc Biol，2009，85（1）：4－19.

［9］GUI MOND MJ，WANG B，CROY BA.Engraft ment of bone marrow from severe combined i mmunodeficient（SCID）mice reverses the reproductive deficits in natural killer cell－deficient tg epsilon 26 mice［J］.J Exp Med，1998，187（2）：217－223.

［10］ASHKAR AA，DI SANTO JP，CROY BA.Interferon gamma contributes to initiation of uterine vascular modification，decidual integrity，and uterine natural killer cell maturation during nor mal murine pregnancy［J］.J Exp Med，2000，192（2）：259－270.

［11］DOMINGUEZ F，GALAN A，MARTIN J，et al.Hor monal and embryonic regulation of chemokine receptors CXCR1，CXCR4，CCR5 and CCR2Bin the hu man endometriu m and the hu man blastocyst［J］.Mol Hu m Reprod，2003，9（4）：189－198.

［12］CABALLERO－CAMPO P，DOMINGUEZ F，COLOMA J，et al.Hor monal and embryonic regulation of chemokines IL－8，MCP－1 and RANTES in the human endometrium during the widow of i mplantation［J］.Mol Hum Reprod，2002，8（4）：375－384.

［13］DRAKE P，RED－HORSE K，F(xiàn)ISHER S.Reciprocal chemokine receptor and ligand expression in the human placenta：i mplications for cytotrophoblast differentiation［J］.Dev Dyn，2004，229（4）：877－885.

［14］STEWART I，PEEL S.Granulated metrial gland cells at i mplantation sites of the pregnant mouse uter us［J］.Anat Embryol（Berl），1980，160（2）：227－238.