趙周婷，胡大海，陶克，劉佳琦，張戰(zhàn)鳳，白曉智

（1.解放軍第211醫(yī)院五官科黑龍江哈爾濱150080；2.第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院燒傷與皮膚外科全軍燒傷中心陜西西安710032）

人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞向表皮細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的研究

趙周婷1，胡大海2，陶克2，劉佳琦2，張戰(zhàn)鳳2，白曉智2

（1.解放軍第211醫(yī)院五官科黑龍江哈爾濱150080；2.第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院燒傷與皮膚外科全軍燒傷中心陜西西安710032）

目的：探索人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞（adipose derived mesenchymal stem cel ls，ADSCs）向表皮細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的方法。方法：以手術(shù)中剩余的人皮下脂肪組織為材料來源，利用膠原酶消化法分離ADSCs，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面標(biāo)記CD29、CD90、CD105的表達(dá)，成脂誘導(dǎo)后油紅O染色鑒定。實驗組利用第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院燒傷與皮膚外科實驗室已成功構(gòu)建的pcDNA3.1(+)/SP+EGF質(zhì)粒經(jīng)脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染的HaCat細(xì)胞，與ADSCs在Transwel l小室中共培養(yǎng)，對照組為ADSCs加入10%FBS培養(yǎng)基，14天后Real time-PCR檢測兩組ADSCs中CK19、integrin-β的mRNA表達(dá)量。結(jié)果：實驗組ADSCs中CK19、integrin-β的mRNA表達(dá)量較對照組明顯升高，且差別有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論：轉(zhuǎn)染EGF的HaCat細(xì)胞可誘導(dǎo)ADSCs向表皮細(xì)胞表型分化，從而為其成為組織工程理想的種子細(xì)胞提供了進(jìn)一步的支持。

脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞；HaCat細(xì)胞；表皮細(xì)胞；組織工程

皮膚缺損是外科領(lǐng)域的常見問題，盡早封閉創(chuàng)面，減少機(jī)體消耗和內(nèi)環(huán)境紊亂是治療皮膚缺損的關(guān)鍵。燒傷外科中大面積燒傷患者皮源缺乏，自體皮膚移植是目前臨床治療全層皮膚缺損最有效的方法。但是自體刃厚皮移植皮片易收縮，不耐摩擦，中厚皮有瘢痕攣縮等問題。隨著組織工程技術(shù)的發(fā)展，皮膚替代物的研究取得了實質(zhì)性的進(jìn)展。種子細(xì)胞的體外培養(yǎng)、擴(kuò)增是組織工程學(xué)研究中最基礎(chǔ)的工作。

2001年，Zuk等[1]首次分離培養(yǎng)出能夠自我復(fù)制、穩(wěn)定增殖，并具有多向分化潛能的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞。ADSCs來自中胚層，在特定條件下可分化為脂肪、骨、軟骨、心肌細(xì)胞、肝細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等[1-5]。ADSCs具有來源豐富、方便取材、低免疫原性、容易體外擴(kuò)增等優(yōu)點，在組織工程、創(chuàng)面修復(fù)及基因治療方面具有良好的應(yīng)用前景。近年研究表明，ADSCs在體外培養(yǎng)過程中加入不同的刺激因子，模擬皮膚的微環(huán)境，能誘導(dǎo)成為具有各種表型的細(xì)胞。Ramos等[6]證實，將分選純化后的ADSCs植入裸鼠體內(nèi)，可顯著促進(jìn)創(chuàng)面愈合，且具有表皮細(xì)胞再生的能力。Derby等[7]將轉(zhuǎn)染GFP+的ADSCs植入小鼠體內(nèi)，8周后可檢測出表皮細(xì)胞的標(biāo)記物p63，證實通過脂肪移植ADSCs可轉(zhuǎn)化為表皮細(xì)胞。人角質(zhì)形成細(xì)胞是皮膚創(chuàng)面修復(fù)的重要細(xì)胞，而表皮生長因子（epithelial growth factor，EGF）是創(chuàng)面修復(fù)過程中的關(guān)鍵因子。EGF能促進(jìn)細(xì)胞增殖、表皮再生、血管形成，同時能刺激表皮細(xì)胞合成分泌膠原、透明質(zhì)酸等細(xì)胞外基質(zhì)，促進(jìn)結(jié)締組織細(xì)胞的生長[8]。Shiki j i等[9]成功地應(yīng)用EGF誘導(dǎo)體外培養(yǎng)于立體膠原表面的人表皮細(xì)胞向膠原內(nèi)生長并形成汗腺管結(jié)構(gòu)。因此，本實驗研究利用pcDNA3.1(+)/SP+EGF質(zhì)粒經(jīng)脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染的HaCat細(xì)胞誘導(dǎo)人ADSCs體外轉(zhuǎn)化為表皮細(xì)胞表型的可行性，為其在組織工程中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 主要儀器與試劑：Ⅰ型膠原酶、胰蛋白酶、IBMX、地塞米松、胰島素、吲哚美辛均購自美國Sigma公司，CD29、CD90、CD105鼠抗人多克隆抗體購自美國Bio Legend公司，TRIZOL購自美國Invit rogen公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green熒光定量試劑盒購自日本TaKaRa生物工程公司，流式細(xì)胞儀購自美國Becton-Dickinson公司、DU800型分光光度計購自美國Beckman CouLter公司，iQ5TM熒光定量PCR儀購自美國Bio-Rad公司。

1.2 ADSCs的分離培養(yǎng)：無菌條件下取外科手術(shù)后剩余人體腹部皮下脂肪組織（患者知情同意）約10g，于1h內(nèi)送至實驗室。在超凈臺內(nèi)于含青霉素（300U/mL）、鏈霉素(300μg/mL)的PBS液中浸泡10min，PBS沖洗，眼科剪將脂肪組織反復(fù)剪碎至1 mm×1mm大小，加入約10ml的0.1%Ⅰ型膠原酶，于37℃水浴鍋內(nèi)劇烈震蕩消化1h，加入10ml的10%FBS中和膠原酶，離心，棄上清，重懸，200目篩網(wǎng)過濾，離心，棄上清，重懸，將細(xì)胞種植于25cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置于37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2孵育箱中。

1.3 ADSCs的鑒定

1.3.1 流式細(xì)胞儀：取生長良好的第三代細(xì)胞，制成5×107/mL單細(xì)胞懸液，分別加入熒光標(biāo)記的鼠抗人多克隆抗體CD29、CD90、CD105各20μl，加入細(xì)胞懸液，混勻，離心，流式細(xì)胞儀檢測。

1.3.2 誘導(dǎo)ADSCs向脂肪細(xì)胞定向分化：待細(xì)胞生長至80%～90%融合時，加入成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基[10]：10%FBS，DMEM，0.5mmol/L IBMX(3-異丁基-1-甲基黃嘌呤)，1μmol/L地塞米松，10μmol/L胰島素，200μmol/L吲哚美辛。

1.4 ELISA檢測HaCat-hEGF細(xì)胞中EGF含量：本實驗室用pcDNA3.1(+)/SP+EGF質(zhì)粒經(jīng)脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染HaCat細(xì)胞，經(jīng)G418長期篩選已成功獲得穩(wěn)定分泌人表皮生長因子的細(xì)胞株。分別收集24、48、 72h內(nèi)HaCat-EGF細(xì)胞的無血清上清液，檢測方法按照檢測試劑盒使用說明進(jìn)行，具體步驟如下：待測品孔每孔加入待測樣品100μL，將反應(yīng)板充分混勻后置于37℃，120min，用洗滌液充分洗滌反應(yīng)板4～6次，在濾紙上印干，每孔加一抗工作液100μL，混勻后置于37℃，60min，洗板，每孔加入酶標(biāo)抗體工作液100μL，置37℃，60min，洗板，每孔加入100μL底物工作液，置37℃暗處反應(yīng)15min，每孔加入100μL終止液混勻，在酶標(biāo)儀上450nm處測吸光度（OD值）。

1.5 實驗分組：分為1個實驗組和1個對照組。實驗組為Transwel l小室共培養(yǎng)，上室為HaCat-hEGF細(xì)胞，下室為ADSCs，加入10%FBS培養(yǎng)基，對照組為ADSCs加10%FBS培養(yǎng)基。培養(yǎng)14天后用TRIZOL提取總RNA，按說明進(jìn)行操作。

1.6 反轉(zhuǎn)錄：利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，反應(yīng)體系為10μL。具體體系為：5×Buf fer 2μL，RT酶0.5μL，Ol igo·dt引物（50μmol/L）0.5μL，6-mer（100μmol/L）0.5μL，RNA 1μg，ddH2O 5.5μL，補足10μL反應(yīng)體系。反應(yīng)條件：37℃，15min，85℃，5s。

1.7 引物設(shè)計：以下引物均由TaKaRa生物工程公司設(shè)計并合成。

表1 實時熒光定量RT-PCR引物序列

1.8 SYBR Green實時熒光定量PCR檢測ADSCs中CK19、integrin-βmRNA表達(dá)：反應(yīng)體系為20μL，SYBR Green混合液10μL，P1（10μmol/L）0.5μL，P2（10μmol/L）0.5μL，cDNA2μL，ddH2O 7μL。反應(yīng)條件為：預(yù)變性95℃30s，變性95℃10s，退火60℃10s，共40個擴(kuò)增循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，CK19、integrin-β為陽性對照，每個樣品基因設(shè)3個復(fù)管。利用iQ5TM熒光定量PCR儀進(jìn)行SYBR Green熒光定量PCR分析，實驗結(jié)果用iQ5軟件行CT相對定量分析。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析：采用SPSS10.0統(tǒng)計軟件包進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±）表示，組間對比采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，＜0.05差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)如圖1～2。

2.2 細(xì)胞表面標(biāo)記物：經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測，ADSCs均一表達(dá)CD29、CD90、CD105，陽性率分別為73.4%、97.3%和80.4%。

2.3 油紅O染色鑒定ADSCs向脂肪細(xì)胞定向分化：

誘導(dǎo)1周后可見細(xì)胞內(nèi)有大小不一的脂滴形成，油紅O染色后可見脂滴被染成橙紅色（如圖3）。2.4 HaCat-EGF細(xì)胞中EGF分泌量：經(jīng)ELISA試劑盒檢測，轉(zhuǎn)染EGF的HaCat細(xì)胞24、48、72h EGF的分泌量分別為：492、622、943ng/L（如圖4）。2.5 SYBR Green實時熒光定量PCR檢測ADSCs mRNA水平（如圖5）。

圖1倒置顯微鏡下觀察到呈梭形的ADSCs

圖2倒置顯微鏡下觀察到呈“鋪路石樣”的HaCat-EGF細(xì)胞

圖3油紅O染色法鑒定ADSCs向脂肪細(xì)胞定向分化

圖4 HaCat-EGF細(xì)胞中EGF分泌量

圖5誘導(dǎo)前后ADSCs CK19、integr in-βmRNA表達(dá)

表2 誘導(dǎo)前后ADSCs CK19、integrin-βmRNA表達(dá)情況比較（±）

表2 誘導(dǎo)前后ADSCs CK19、integrin-βmRNA表達(dá)情況比較（±）

注：與對照組比較，a＜0.05，b＜0.01。

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3 討論

ADSCs憑借其來源豐富、取材容易、對機(jī)體損傷小、體外增殖迅速、生物學(xué)性狀穩(wěn)定等優(yōu)點，已成為細(xì)胞移植及組織工程理想的種子細(xì)胞，是人體干細(xì)胞庫潛在的重要來源。本實驗從外科手術(shù)中剩余的腹部皮下脂肪組織為來源，采用膠原酶消化法及DMEM培養(yǎng)法分離得到細(xì)胞。目前，CD29、CD90、CD105被公認(rèn)為具有多向分化潛能細(xì)胞的標(biāo)記分子，而造血細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞的標(biāo)記分子，如CD34在ADSCs中是否表達(dá)卻存在爭議。在本實驗中，ADSCs經(jīng)流式細(xì)胞儀分析證實CD29、CD90、CD105表達(dá)為陽性。干細(xì)胞與終末分化細(xì)胞的不同之處不僅在于細(xì)胞表面標(biāo)記分子表達(dá)情況不同，而且前者具有多向分化的能力，因此鑒定ADSCs最好的方法是進(jìn)行多向分化誘導(dǎo)并進(jìn)行相應(yīng)檢測以確定誘導(dǎo)成功。故本實驗采用成脂誘導(dǎo)分化實驗對培養(yǎng)細(xì)胞的干細(xì)胞特性進(jìn)行鑒定。

本實驗利用pcDNA3.1(+)/SP+EGF質(zhì)粒經(jīng)脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染的HaCat細(xì)胞與ADSCs共培養(yǎng)，通過轉(zhuǎn)染EGF的HaCat細(xì)胞分泌EGF，以及HaCat細(xì)胞分泌的其他細(xì)胞因子作用于ADSCs，使ADSCs向表皮細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化。構(gòu)建的EGF基因表達(dá)載體不但可以經(jīng)體外培養(yǎng)及活體途徑轉(zhuǎn)入人角質(zhì)形成細(xì)胞，同時可借助外分泌機(jī)制參與對鄰近細(xì)胞的生長調(diào)控。CK19、integrin-β被認(rèn)為是表皮干細(xì)胞的重要標(biāo)記物[11-12]。研究表明，缺少integrin-β會嚴(yán)重影響表皮的分化和形成，其介導(dǎo)表皮干細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的粘附，還調(diào)控終末分化的啟動[13]。因此，本研究選擇CK19、integrin-β作為檢測ADSCs分化的指標(biāo)。

本實驗成功誘導(dǎo)了ADSCs向表皮細(xì)胞表型的定向分化，對臨床上解決大面積燒傷、嚴(yán)重創(chuàng)傷病人的皮源緊缺以及促進(jìn)創(chuàng)面修復(fù)等問題提供了新的探索途徑，為ADSCs成為表皮組織工程學(xué)研究的理想種子細(xì)胞奠定了基礎(chǔ)。

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Ce llu la r pheno type transd iffe ren tia tion o f hum an a d ipose d e rived m esenchym a l stem ce lls to ep ithe lia l ce lls

ZHAO Zhou-ting1,HU Da-hai2,TAO Ke2,LIU Jia-qi2,ZHANG Zhan-feng2,BAIXiao-zh i2
（1.Departmentof E.N.T,The 211stHospitalof PLA,Harb in 150080,Heilong jiang,China;2.Burns Center of PLA,Departm ent of Burns and Cutaneous Surgery,Xijing Hosp ital,The Fourth Military Medical University,Xi'an 710032,Shaanxi,China）

Ob jective To exp lore a method that inverts human adipose derived mesenchymal stem cells into epithelial cells.M ethods The subcutaneous adipose tissue was collected from the operation.Primary ADSCs were isolated subsequently by the methods of stirring digestion within collagenase typeⅠ.The membrane antigens exp ression of cells,such as CD29,CD90,CD105 were detec ted through flow cytometry(FCM).Adipocyte d ifferentiation cells were stained for fat vacuoles using the Oil red O staining kit.The experiment group used pcDNA3.1(+)/SP-hEGFmod ified HaCat cells thatwas successfully created from our laboratory,and co-cultured w ith ADSCs in Transwell.The control group was DMEM supp lem ented with fetalbovine serum for ADSCs.After inducing two weeks, the exp ression of CK19 and integ rin-βmRNA were assessed by quantitative realtime PCR.Resu lts The exp ression level of CK19 and integrin-βmRNA in the experiment group were obviously more than the control g roup,and there were significant statistical d ifferences between two groups. Conclutions EGF transfec ted HaCat cells could induce ADSCs to invert to epithelial cells,which w ill furthermake ADSCs as idealseed cells for tissue eng ineering.

ad ipose derived mesenchymalstem cells；HaCat cells；epithelial cells；tissue eng ineering

R751 R64

A

1008-6455（2014）22-1900-04

2014-09-11

2014-10-05

編輯/何志斌

國家自然科學(xué)基金面上項目(81372078)