蘇顯明，楊 偉，何亞軍，王小芹，段 靜，張 瑋，馬 奕

(1西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院老年心血管內(nèi)科， 西安 710061;2陜西省核工業(yè)215醫(yī)院心內(nèi)科)

隨著人體衰老，心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)也同人體其他器官一樣，發(fā)生退行性改變。竇房結(jié)作為維持人體心臟跳動(dòng)的最高起搏點(diǎn)，也會(huì)隨著年齡的增長(zhǎng)，由于各種原因的影響，發(fā)放沖動(dòng)的次數(shù)漸漸減少，在臨床上表現(xiàn)為竇性心動(dòng)過(guò)緩、竇性停搏等改變。最近的研究發(fā)現(xiàn)血漿 Klotho蛋白和機(jī)體的衰老有關(guān)［1］，klotho基因在心臟表達(dá)僅限于竇房結(jié)，對(duì)竇房結(jié)具有保護(hù)作用［2，3］。本研究對(duì)75歲以上老年緩慢竇性心律患者進(jìn)行血漿Klotho蛋白水平檢測(cè)，以探討高齡老年人緩慢竇性心律與血漿Klotho蛋白之間的關(guān)系。

1 資料及方法

1.1 臨床資料

隨機(jī)選擇2009－07～2011－06先后西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院老年心血管內(nèi)科收治的75歲以上不重復(fù)住院患者225例，征得患者及家屬同意，對(duì)入院時(shí)心電圖提示為竇性心動(dòng)過(guò)緩(心室率≤55次/min)116例(排除服用心率減慢藥物的患者12例，剩余104例構(gòu)成實(shí)驗(yàn)組)，心電圖正?；颊?09例作為對(duì)照組;對(duì)實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組患者均進(jìn)行動(dòng)態(tài)心電圖(Holter)監(jiān)測(cè)。實(shí)驗(yàn)組患者年齡75－95歲，平均(77.17±2.21)歲，男性 72例，女性 32例。其中高血壓病43例，冠心病40例，其他(如單純心律失常等)21例。對(duì)照組患者年齡75－95歲，平均(76.36±2.41)歲，男性76例，女性33例。其中高血壓病46例，冠心病44例，其他19例。所有入選患者入院時(shí)均經(jīng)過(guò)詢問(wèn)病史、體格檢查、X線檢查、心電圖、超聲心動(dòng)圖以及相關(guān)實(shí)驗(yàn)室檢查等，排除了急慢性肝、腎疾病、腫瘤、腦血管病、周圍血管性疾病等。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)態(tài)心電圖監(jiān)測(cè) 采用中健公司BIOX－200型動(dòng)態(tài)心電圖記錄和分析儀，MV5及MV1導(dǎo)聯(lián)，每例均連續(xù)記錄24 h。自動(dòng)分析與專人核對(duì)每份記錄結(jié)果。對(duì)并存各種早搏、房顫等心律失常均以基礎(chǔ)心律記錄之。將104例患者按動(dòng)態(tài)心電圖結(jié)果分為三個(gè)亞組:竇性心動(dòng)過(guò)緩組、竇性停搏組及房室傳導(dǎo)阻滯組。當(dāng)竇性心動(dòng)過(guò)緩、竇性停搏及房室傳導(dǎo)阻滯同時(shí)出現(xiàn)在同一份記錄中時(shí)記入竇性停搏組;竇性心動(dòng)過(guò)緩與房室傳導(dǎo)阻滯同時(shí)出現(xiàn)在同一份記錄中時(shí)記入房室傳導(dǎo)阻滯組。

1.2.2 采血與血漿Klotho蛋白檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組患者，采晨起空腹肘靜脈血3－5 mL后于2 000 r/min離心10 min，吸取上清液封口后于－80℃冰箱保存待測(cè)。檢測(cè)時(shí)將患者血清按1∶10稀釋后加入96孔板中，每孔0.1 ml，4℃過(guò)夜;次日棄去孔內(nèi)液體，用含有吐溫－20 PBS洗滌液清洗5次;加入英國(guó)abcam公司提供的抗血漿 Klotho蛋白抗體(ab76356)。klotho抗體用含牛血清白蛋白PBS稀釋，稀釋比例1∶12 500，稀釋后加入96孔板中，每孔0.1 ml置入37℃溫箱孵育1 h;棄去液體，用含有吐溫－20的PBS洗滌液清洗5次;加入辣根酶標(biāo)記的山羊抗兔抗體，用含牛血清白蛋白PBS稀釋，稀釋比例1∶2 000，稀釋后加入96孔板中，每孔0.1 ml置入37℃溫箱孵育1 h;棄去液體，用含有吐溫－20 PBS洗滌液清洗5次;加入新鮮配制成的TBM顯色劑每孔0.1 ml置入37℃溫箱孵育30 min，終止液終止反應(yīng)。于美國(guó)產(chǎn)酶標(biāo)儀(型號(hào)550)中測(cè)讀。所有值至少重復(fù)檢測(cè)2次。

1.2.3 病例分組 根據(jù)動(dòng)態(tài)心電圖檢查結(jié)果，將104例竇性心動(dòng)過(guò)緩患者分為:竇性心動(dòng)過(guò)緩組43例，竇性停搏組36例，房室傳導(dǎo)阻滯組25例(其中Ⅰ度19例、Ⅱ度以上16例)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 患者基礎(chǔ)情況比較

兩組患者性別構(gòu)成、年齡、合并疾病(高血壓、冠心病及其他疾病)以及肝腎功能、血脂、血糖之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05，見(jiàn)表1)。

表1 兩組患者一般資料比較Tab 1 Comparison of baseline between experiment group and control gruop

2.2 高齡老年緩慢性竇性心律患者klotho水平比較

104 例高齡老年緩慢性竇性心律患者血漿Klotho蛋白吸光度明顯降低，與對(duì)照組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。竇性停搏組患者血漿Klotho蛋白吸光度均低于竇性心動(dòng)過(guò)緩組及房室傳導(dǎo)阻滯組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);而竇性心動(dòng)過(guò)緩組與房室傳導(dǎo)阻滯組患者血漿Klotho蛋白吸光度比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05，見(jiàn)表2)。

表2 實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組klotho水平比較Tab 2 Comparison of klotho protein expression between experiment group and control group

2.3 竇性停搏發(fā)生次數(shù)與klotho水平相關(guān)性

36例竇性停搏患者按24 h停搏發(fā)生次數(shù)與血漿Klotho蛋白吸光度進(jìn)行Pearson相關(guān)性檢驗(yàn)，結(jié)果顯示klotho吸光度隨停搏次數(shù)增加而降低，兩者存在負(fù)相關(guān)(r=－0.888 4，P＜0.05，見(jiàn)圖1)。

圖1 竇性停博次數(shù)與血漿klotho水平之間的相關(guān)關(guān)系Fig 1 The correlation between total times of sinus arrest and the level of plasma Klotho protein

3 討論

隨著年齡的增長(zhǎng)，竇房結(jié)的功能因疾病及退行性改變而減低，這是老年人發(fā)生心律失常的重要原因之一。竇性心動(dòng)過(guò)緩多見(jiàn)于老年人群，本資料中入院時(shí)發(fā)現(xiàn)竇性心動(dòng)過(guò)緩病例(除應(yīng)用影響心率減慢治療者外)占所有病人數(shù)的46.22%(104/225)。這可能與患者高齡、竇房結(jié)退變加重導(dǎo)致心室率減慢有關(guān)。

klotho基因是Kruo等［1］在1997年研究自發(fā)性高血壓時(shí)發(fā)現(xiàn)的與衰老有關(guān)的新基因，該基因定位于染色體13q12區(qū)域［4，5］，由5個(gè)外顯子和4個(gè)內(nèi)含子組成，全長(zhǎng)50 kb。人、小鼠、大鼠的klotho cDNA長(zhǎng)度約為5.2 kb，外顯子總長(zhǎng)分別為3 022，3 036，3 042 bp。人、小鼠、大鼠 klotho之間有同源性，人和小鼠間有80%的同源性，人和大鼠間有83%的同源性。研究表明，klotho基因mRNA外顯子有一內(nèi)在剪切位點(diǎn)，如果這一位點(diǎn)接受50 bp片段插入，其RNA就表達(dá)3個(gè)外顯子，從而編碼分泌型蛋白，其分泌型蛋白大約549個(gè)氨基酸［6］。近年來(lái)，從基因結(jié)構(gòu)、基因的表達(dá)、蛋白產(chǎn)物及其功能等各個(gè)方面，大量學(xué)者進(jìn)行了許多深入的研究，然而有關(guān)klotho的心血管功能方面研究一直是研究的難點(diǎn)，2003年Takeshita等［3］研究發(fā)現(xiàn)，klotho對(duì)竇房結(jié)具有保護(hù)作用，但其確切的作用機(jī)制至今仍未闡明。

本研究測(cè)定老年人血漿Klotho蛋白吸光度，竇性心動(dòng)過(guò)緩組患者血漿Klotho蛋白吸光度較對(duì)照組低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，竇性停搏組患者血漿Klotho蛋白吸光度也分別低于竇性心動(dòng)過(guò)緩組及房室傳導(dǎo)阻滯組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，患者klotho吸光度隨停搏次數(shù)增加而降低，兩者存在負(fù)性關(guān)系(r=－0.888 4，P＜0.05)。說(shuō)明血漿Klotho蛋白對(duì)維持竇房結(jié)正常起搏功能起著非常重要的作用，隨著人體逐漸衰老，血漿Klotho蛋白含量減少，致使竇房結(jié)因失去正常保護(hù)而功能減低，這可能是老年患者易發(fā)生緩慢竇性心律失常的重要原因之一。

本研究結(jié)果提示，對(duì)緩慢竇性心律失常尤其是竇性停搏患者，血漿Klotho蛋白水平在一定程度上可以反映竇房結(jié)起搏功能狀態(tài)，可以作為評(píng)價(jià)竇房結(jié)功能的指標(biāo)之一。由于研究資料有限，血漿Klotho蛋白如何保護(hù)竇房結(jié)正常功能的機(jī)制目前仍不清楚，仍需要大量基礎(chǔ)及臨床研究加以闡明。

［1］Kuro M，Matsumura Y，Aizawa H，etal.Mutation of the mouse klotho gene leads to a syndrome resembling aging ［J］.Nature，1997，390:45－51.

［2］Opthof T.Function and structure of the mouse sinus node:nothing you can see that isn’t shown ［J］.Cardiovasc Res，2001，52(1):1－4.

［3］Takeshita K，F(xiàn)ujimori T，Kurotaki Y，etal.Sinoatrial node dysfunction and early unexpected death of mice with a defect of klotho gene expression［J］.Circulation，2004，109(8):1776－1782.

［4］Shiraki-Iidat，Aizawa H，Matsumura Y，etal.Structure of the mouse klotho gene and its two transcripts encoding membrane and secreted protein［J］.FEBSLett，1998，424(1－2):6－10.

［5］Saito Y，Kuro-Om，Nabeshima Y，etal.The protective roleof klotho gene on vascular endothelium ［J］.Nippon Rinsho，1999，57(7):1514－1518.

［6］Imura A，Aiwano A，Tohyama O，etal.Secreted Klotho protein in sera and CSF:implication for post-translational cleavage in release of Klotho protein from cell membrane［J］.FEBSLett，2004，565(1):143－147.