聶瑞紅，呂利華，魏國琴，王桂琴，趙良啟*

(1山西大學(xué)化學(xué)生物學(xué)與分子工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 太原030006;2山西晉城無煙煤礦業(yè)集團(tuán)有限公司;3山西醫(yī)科大學(xué)微生物學(xué)與免疫學(xué)教研室;*通訊作者，E-mail:liangqi@sxu.edu.cn)

生物多糖，不僅是生物機(jī)體結(jié)構(gòu)的組成成分，而且是一類具有重要生物功能的活性物質(zhì)［1，2］，在機(jī)體生命活動過程中扮演著重要角色，例如信號識別、細(xì)胞分化、免疫調(diào)節(jié)等。如今，多糖生物學(xué)已成為繼核酸、蛋白質(zhì)生物學(xué)研究之后的又一大學(xué)科分支。生物多糖的應(yīng)用研究已取得較大進(jìn)展，越來越多的功能多糖從動物、植物和微生物中被開發(fā)出來。一些多糖具有抗腫瘤、抗氧化、抗衰老和提高免疫力等功能，已用于生物醫(yī)藥［3，4］。

目前，在已分離得到的多種生物活性多糖中，有一些多糖已顯示出較好的醫(yī)療功效和應(yīng)用價值，然而其理化性質(zhì)和生物活性仍有待改善和提高。改善多糖相關(guān)性質(zhì)的方法有多種，但最為有效的方法是分子修飾。迄今為止，已有羥甲基化、硫酸酯化、硒化、羧甲基化等方法應(yīng)用于多糖修飾，在改善多糖理化性質(zhì)和生物活性方面取得了一定進(jìn)展［5］。

我們實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)應(yīng)用微波輻照氧化技術(shù)降解Rhizobium sp.N613(REPS)獲得了一種小分子Rhizobium sp.N613(LREPS)［6－8］，極大地改善了原多糖的溶解性。本文擬以乙醇為溶劑，應(yīng)用一氯乙酸對LREPS進(jìn)行羧甲基化修飾，通過正交試驗(yàn)優(yōu)化羧甲基化LREPS(CM-LREPS)的制備工藝條件。選用不同取代度的CM-LREPS進(jìn)行抗腫瘤活性測定，以取代度和抑瘤率為檢測指標(biāo)確定CM-LREPS的最佳制備工藝條件，為CM-LREPS的開發(fā)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

LREPS，由本實(shí)驗(yàn)室發(fā)酵純化降解制得，純度達(dá)99%以上，分子量為10.352 kD。一氯乙酸、氫氧化鈉、冰醋酸、無水乙醇、溴化鉀，以上試劑均為分析純，均購自天津化學(xué)試劑三廠。

1.2 主要儀器

pH計(jì) (德國inolab公司)，CR22G高速冷凍離心機(jī)(日本日立公司)，Heto-PL3000－冷凍干燥機(jī)(捷克熱力電器公司)，傅立葉變換紅外光譜儀 (美國Mattson公司)。

1.3 試驗(yàn)動物與腫瘤細(xì)胞株

健康昆明種小鼠，4－5周齡，購于山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心。小鼠肝癌腹水瘤H22細(xì)胞株購于山西省腫瘤醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物中心。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 CM-LREPS 制備及工藝條件優(yōu)化 CMLREPS制備方法:乙醇為溶劑，按一定的物料比，將乙醇、一氯乙酸、氫氧化鈉及LREPS分別加入反應(yīng)器中，充分?jǐn)噭蚝笠迫牒銣厮≌袷幤髦?，待物料升溫至反?yīng)溫度，保溫進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)完成后加入冰醋酸，中和pH為7.0。先以自來水透析再以蒸餾水透析，加入3倍體積乙醇沉淀，離心棄上清，冷凍干燥法獲得一系列CM-LREPS產(chǎn)物。

CM-LREPS分子結(jié)構(gòu)測定:LREPS與 CMLREPS的結(jié)構(gòu)比較采用溴化鉀壓片法，分別稱取5 mg LREPS和CM-LREPS，與400 mg KBr粉末混合研磨、壓片，采用紅外光譜儀掃描分析，掃描范圍為4 000－500/cm。

取代度(DS)和CM-LREPS取代度的測定:取代度指平均每個失水葡萄糖單元上被反應(yīng)試劑取代的羥基數(shù)目。CM-LREPS取代度的測定采用硫酸銅沉淀法［9］。

正交試驗(yàn)優(yōu)化CM-LREPS制備條件:在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，選取乙醇體積分?jǐn)?shù)、LREPS用量、一氯乙酸用量、氫氧化鈉用量、醚化溫度及時間為因素，采用L25(56)正交表優(yōu)化CM-LREPS制備條件，因素水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 CM-LREPS正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平表Tab 1 Factors and levels of orthogonal test for CM-LREPS

1.4.2 CM-LREPS生物學(xué)活性測定及最佳制備工藝確定 不同取代度CM-LREPS的抗腫瘤及免疫活性測定:供試?yán)ッ鞣N雌性小鼠隨機(jī)分組，每組10只。抽取接種1周左右的小鼠肝癌腹水瘤H22，以生理鹽水配制成106個/ml的腫瘤細(xì)胞懸液，在每只小鼠左腋皮下接種0.2 ml，建立荷瘤小鼠模型。接種24 h后，每日1次腹腔注射0.2 ml試樣溶液，不同取代度的CM-LREPS劑量為10 mg/kg體重，陽性對照組環(huán)磷酰胺(Cy)的劑量為20 mg/kg體重，陰性對照組注射生理鹽水，連續(xù)給藥10 d，每日定時稱重小鼠體重并記錄。連續(xù)給藥10d停藥，次日稱量小鼠體重?cái)囝i處死，摘取小鼠脾臟及胸腺，剝?nèi)⌒∈笞笠赶铝鰤K分別稱量脾臟、胸腺和瘤塊重量并計(jì)算平均值［7］。

CM-LREPS最佳制備工藝條件確定:根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果和不同取代度CM-LREPS的抑瘤率，確定CM-LREPS的最佳制備工藝條件。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同取代度CM-LREPS的制備

應(yīng)用L25(56)正交表進(jìn)行了25組實(shí)驗(yàn)并得到一系列取代度不同的CM-LREPS。CM-LREPS試驗(yàn)結(jié)果和方差分析見表2、表3。

表2 CM-LREPS正交試驗(yàn)結(jié)果Tab 2 Orthogonal test results of CM-LREPS

表3 CM-LREPS方差分析Tab 3 Analysis of variance of CM-LREPS

由表2正交試驗(yàn)結(jié)果可以看出，實(shí)驗(yàn)成功獲得了一組不同取代度的羧甲基化LREPS樣品及其相應(yīng)的制備工藝參數(shù)。由表3可以看出，影響LREPS羧甲基化的因素順序是:醚化溫度＞乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞一氯乙酸用量＞LREPS用量＞氫氧化鈉用量＞反應(yīng)時間。通過調(diào)整醚化溫度，乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)及其一氯乙酸用量，能夠有效改變CM-LREPS的取代度。

CM-LREP結(jié)構(gòu)的紅外分析(圖1)顯示，兩種純多糖在4 000－500/cm范圍內(nèi)有糖類特征吸收峰，3 400/cm附近出現(xiàn)的寬峰是分子內(nèi)或分子間O－H伸縮振動的結(jié)果。CM-LREPS樣品在1 720/cm附近的吸收峰為CCA羧基形成的酯鍵 (－COOR)C=O的伸縮振動。1 636/cm的強(qiáng)吸收峰為羧酸鹽(－COO－)的不對稱伸縮振動，同時也是糖水化物樣品的特征吸收峰［10］。綜上所述，經(jīng)羧甲基修飾后，LREPS結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化。

2.2 CM-LREPS生物學(xué)活性測定及最佳制備工藝確定

以 LREPS 和CM-LREPS(DS=0.285、0.531、0.659和0.899)代表性樣品進(jìn)行體內(nèi)鼠肝癌H22抗腫瘤和免疫活性試驗(yàn)，結(jié)果見表4。

從表4可以看出，取代度的大小與抑瘤率有著直接關(guān)系，不同的取代度抑瘤作用不相同。取代度最低組 (DS=0.285)和取代度中等組 (DS=0.531和DS=0.659)的抑瘤率較修飾前LREPS都有所提高，其中取代度為0.659的CM-LREPS抑瘤率最高，達(dá)到59.2%。而當(dāng)取代度達(dá)到0.899時，其抗腫瘤活性降低到49.2%。可見CM-LREPS對H22腫瘤細(xì)胞抑制作用有其最適的取代度取值范圍。陽性對照組(環(huán)磷酰胺)抑瘤效果最為明顯，但是顯著降低了小鼠的胸腺與脾臟指數(shù)，對小鼠產(chǎn)生了毒副作用。而LREPS及CM-LREPS可顯著增加小鼠胸腺，脾臟的重量，增強(qiáng)了荷瘤小鼠的免疫功能。本實(shí)驗(yàn)中綜合考察了不同取代度CM-LREPS對小鼠肝癌H22抑瘤率及臟器指數(shù)的影響，療效最好的CM-LREPS取代度在0.659左右。

圖1 CM-LREPS與LREPS紅外圖譜比較Fig 1 Comparison of infrared spectra between CM-LREPS and LREPS

表4 CM-LREPS和LREPS對H22荷瘤小鼠瘤重及臟器指數(shù)的影響Tab 4 Antitumor activity，thymus and spleen index of CM-LREPS and LREPSagainst H22

以羧甲基化LREPS的取代度及抗腫瘤活性為檢測指標(biāo)，確定CM-LREPS的最佳制備工藝條件:乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為90%，LREPS用量為2.0 g，一氯乙酸用量為3.0 g，氫氧化鈉用量為4.0 g，醚化溫度為40℃，反應(yīng)時間為4 h。

3 討論

本文以實(shí)驗(yàn)室開發(fā)的小分子量錦雞兒根瘤菌多糖LREPS為基本原料，一氯乙酸為修飾劑，通過改變底物加量、反應(yīng)體系酸堿度、醚化溫度和反應(yīng)時間等條件，制備羧甲基化小分子多糖—CM-LREPS。紅外光譜分析表明實(shí)現(xiàn)了LREPS的羧甲基化。通過正交試驗(yàn)考察了乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)、LREPS、一氯乙酸、氫氧化鈉用量、醚化溫度及時間對CM-LREPS取代度的影響并在獲得一系列CM-LREPS產(chǎn)物的同時建立了CM-LREPS的制備工藝。本試驗(yàn)中羧甲基化反應(yīng)時間短，反應(yīng)副產(chǎn)物少，無有毒副產(chǎn)物生成，反應(yīng)過程簡單。在實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)，通過調(diào)整醚化溫度、乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)、一氯乙酸可以顯著影響CMLREPS的取代度，而LREPS用量、氫氧化鈉用量及反應(yīng)時間對CM-LREPS的取代度影響較小。

以取代度和抗腫瘤活性為指標(biāo)，進(jìn)一步確定了CM-LREPS的最佳制備工藝條件。本文為今后羧甲基化多糖在保健或藥物開發(fā)方面提供了一定的參考價值，CM-LREPS的抗腫瘤作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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