劉曉玲 由 瑋 左玲蓮 宋明君 劉桂霞 石 磊 陳永清 孫德萬(wàn)

(煙臺(tái)市萊陽(yáng)中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，山東 萊陽(yáng) 265200)

多發(fā)性硬化(MS)是人類(lèi)中樞神經(jīng)系統(tǒng)常見(jiàn)的炎性脫髓鞘 性疾病，其病因和發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，一般認(rèn)為是遺傳易感個(gè)體與環(huán)境因素相互作用而發(fā)生的自身免疫性疾病，以髓鞘脫失、神經(jīng)膠質(zhì)增生、不同程度的軸索病變和進(jìn)行性神經(jīng)功能紊亂為主要特點(diǎn)〔1〕。實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎 (EAE)的病理學(xué)、免疫學(xué)和臨床表現(xiàn)都與MS極為相似，因而成為公認(rèn)的研究MS免疫病理學(xué)機(jī)制及其實(shí)驗(yàn)性治療的最佳動(dòng)物模型〔2〕。CD4+CD25+T細(xì)胞是調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的亞群之一，能抑制自身反應(yīng)性T、B細(xì)胞的活化增殖以及免疫球蛋白的產(chǎn)生〔3〕。大量實(shí)驗(yàn)表明CD4+CD25+T細(xì)胞的減少或功能降低會(huì)導(dǎo)致自身免疫性疾病的發(fā)生。來(lái)氟米特(LEF)是一種化學(xué)結(jié)構(gòu)獨(dú)特、作用機(jī)制新穎的新型免疫抑制劑，具有免疫抑制及抗增殖作用，與其他免疫抑制劑相比，具有多環(huán)節(jié)作用(抑制嘧啶合成，抑制蛋白酪氨酸激酶活性等)的特點(diǎn)，并具有抗病毒作用?，F(xiàn)臨床主要用于治療類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎〔4〕、系統(tǒng)性紅斑狼瘡在內(nèi)的自身免疫性疾病;及免疫介導(dǎo)性疾病，如腎炎腎病、移植排異反應(yīng)等〔5〕，在風(fēng)濕病、腎臟病、皮膚病、器官移植領(lǐng)域有廣闊的臨床應(yīng)用前景。本研究采用EAE大鼠作為動(dòng)物模型，給予不同劑量LEF及甲潑尼龍治療，觀察藥物對(duì)大鼠神經(jīng)功能及血CD4+CD25+T細(xì)胞的影響，探討LEF治療EAE的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雌性Wistar大鼠100只，體重190～230 g，6～8周齡，由山東省中醫(yī)藥學(xué)校實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供;健康雌性豚鼠25只，體重300～400 g，由山東省中醫(yī)藥學(xué)校實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。均于山東省中醫(yī)藥學(xué)校實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心動(dòng)物房在恒溫22℃、相對(duì)濕度65% ～70%、光照周期12 h環(huán)境中，用標(biāo)準(zhǔn)混合飼料適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w后進(jìn)入實(shí)驗(yàn)。

1.2 主要試劑與儀器 LEF購(gòu)自蘇州長(zhǎng)征-欣凱制藥有限公司;甲潑尼龍購(gòu)自大連輝瑞制藥有限公司;CD4-FITC單標(biāo)抗體、CD4-FITC/CD25-PE雙標(biāo)抗體以及相應(yīng)的對(duì)照抗體由美國(guó)BD公司提供。

1.3 方法

1.3.1 EAE大鼠模型制備

1.3.1.1 完全抗原的制備 取液體石蠟40 ml、羊毛脂20 g混合，加熱并融化制得不完全弗氏佐劑(IFA)，分裝入10 ml小瓶高壓滅菌后4℃冰箱保存。豚鼠用10%水合氯醛350 mg/kg腹腔注射至四肢癱軟，無(wú)菌狀態(tài)下剪開(kāi)胸腔、剝離心包，0.9%生理鹽水左心室灌注直至肝臟變白，迅速取其脊髓，小心剝離脊膜后稱(chēng)重，加入等量生理鹽水，制成50%(W/V)全脊髓勻漿(GPSCH)。同時(shí)融化IFA，1 ml IFA加入約10 mg的卡介苗，即制得完全弗氏佐劑(CFA)。將CFA與GPSCH等體積混合，在冰上用注射器反復(fù)抽推，制成油包水乳液，制成完全抗原，放置冰上備用。

1.3.1.2 模型制備 健康雌性Wistar大鼠100只，隨機(jī)取12只作為正常對(duì)照組，其余88只進(jìn)行造模。88只大鼠四肢足墊皮下及頸部皮下分別注射完全抗原(GPSCH/CFA)0.1 ml，即0.5 ml/只，足背皮內(nèi)注射百日咳桿菌抗原0.01 ml/只(含3.0×109個(gè)菌體);12只對(duì)照大鼠四肢足墊皮下及頸部皮下分別注射等量的生理鹽水/CFA乳液。免疫當(dāng)日記為0 d。

1.3.2 動(dòng)物模型鑒定

1.3.2.1 神經(jīng)功能評(píng)分 免疫當(dāng)日和免疫后所有動(dòng)物每日進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分(Duckers評(píng)分)〔6〕。0分：不發(fā)病;1分：尾部張力降低或輕度步態(tài)笨拙;2分：尾部無(wú)張力和(或)后肢中度無(wú)力;3分：雙側(cè)后肢麻痹;4分：后肢麻痹伴前肢力弱或麻痹;5分：因EAE而瀕臨死亡或死亡。評(píng)分≥1分為造模成功。

1.3.2.2 腦、脊髓組織病理檢查 模型大鼠采用10%水合氯醛腹腔麻醉后灌注處死。分別取脊髓頸膨大、胸段、腰膨大及全腦，4%多聚甲醛固定，梯度酒精脫水，石蠟包埋、切片，HE染色后光鏡觀察。

1.3.3 實(shí)驗(yàn)分組及給藥方法 造模成功且存活的大鼠共50只，與12只對(duì)照大鼠共分為5組，按以下方法給藥。LEF大劑量組：0.3 mg·kg－1·d－1灌胃給藥;LEF 小劑量組：0.2 mg·kg－1·d－1灌胃給藥;甲潑尼龍組：30 mg·kg－1·d－1尾靜脈注射給藥;模型組：等量生理鹽水灌胃;對(duì)照組：等量生理鹽水灌胃。給藥時(shí)間均為14 d。

1.3.4 神經(jīng)功能評(píng)分 給藥后每天觀察記錄神經(jīng)功能評(píng)分(Duckers評(píng)分)。

1.3.5 血CD4+CD25+T淋巴細(xì)胞比例觀察 給藥后第15天，將大鼠以水合氯醛腹腔麻醉后，心臟穿刺取血，EDTA抗凝。取抗凝全血各 100 μl，分別加入 CD4-FITC 10 μl、CD4-FITC 和CD25-PE各10 μl，混勻后室溫避光孵育20 min，陰性對(duì)照均以同型抗體代替。然后加入1∶10溶血素(FACS溶解液)2 ml，迅速于混旋器上混勻，置室溫處放置10 min，以2 000 r/min離心10 min，棄上清液，加入PBS液2 ml洗滌，以2 500 r/min離心5 min;棄上清液，加入0.5 ml PBS混勻后上流式細(xì)胞儀，檢測(cè)CD4+T細(xì)胞、CD4+CD25+T細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)。

1.3.6 腦、脊髓組織病理檢查 心臟取血后立即心臟灌注處死動(dòng)物，取脊髓及全腦，HE染色后光鏡觀察。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS13.0軟件行方差分析，各組數(shù)據(jù)以s表示，進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 EAE發(fā)病動(dòng)物的神經(jīng)功能狀況 經(jīng)生理鹽水/CFA免疫的12只對(duì)照大鼠未出現(xiàn)癥狀，體重持續(xù)增長(zhǎng)，活動(dòng)度正常。經(jīng)完全抗原免疫的88只大鼠有64只發(fā)病，其中1分16只;2分14只;3分14只;4分6只;5分14只，發(fā)病率為72.1%。麻醉意外及免疫后急性期死亡8只，評(píng)分5分的大鼠在發(fā)病達(dá)高峰時(shí)死亡。造模成功且存活的大鼠為50只，免疫后第12天首例出現(xiàn)臨床癥狀，以后發(fā)病數(shù)逐漸增多，多數(shù)在12～15 d出現(xiàn)癥狀，癥狀出現(xiàn)后3～4 d發(fā)病達(dá)高峰。癥狀先表現(xiàn)為尾部張力減低，隨后出現(xiàn)活動(dòng)減少、食欲不振、體重下降明顯、毛色晦暗、雙后肢麻痹，嚴(yán)重者發(fā)展為四肢癱瘓、喂食時(shí)咀嚼無(wú)力、不能進(jìn)水、尿便障礙至瀕臨死亡。

2.2 治療后EAE發(fā)病動(dòng)物的神經(jīng)功能狀況 用藥治療后，EAE大鼠臨床癥狀逐漸緩解，麻痹、癱瘓的四肢逐漸恢復(fù)，攝食攝水量增多，活動(dòng)增加甚至活動(dòng)靈敏度接近正常。模型組大鼠癥狀可在造模第20天后開(kāi)始自行緩解，緩解速度及程度較治療組小。隨著臨床癥狀的緩解，EAE大鼠體重也逐漸增加。

2.3 病理學(xué)改變 造模成功的EAE大鼠組織病理學(xué)主要表現(xiàn)為急性血管炎改變，脊髓實(shí)質(zhì)內(nèi)、蛛網(wǎng)膜下腔及側(cè)腦室脈絡(luò)叢小血管充血，管周有大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)，形成“血管套”樣改變。腦部的炎性灶主要分布于白質(zhì)內(nèi)，如丘腦髓紋、視交叉上方、胼胝體等部位，在腦室周?chē)梢?jiàn)不規(guī)則的壞死區(qū)。脊髓的損害較腦為重，以腰骶段最為顯著，白質(zhì)較灰質(zhì)明顯。對(duì)照組的神經(jīng)組織病理檢查未見(jiàn)異常，這與此組未出現(xiàn)臨床癥狀吻合。治療后各治療組大鼠腦和脊髓組織病理學(xué)改變與模型組相比，均有不同程度減輕，病灶區(qū)域的炎性浸潤(rùn)細(xì)胞數(shù)及“血管套”樣改變明顯少于模型組，以LEF大劑量組改變最明顯(圖1)。

2.4 治療后各組血CD4+T細(xì)胞、CD4+CD25+T細(xì)胞的百分率比較 見(jiàn)表1。

圖1 EAE大鼠脊髓(HE，×200)

表1 各組大鼠治療后血CD4+T細(xì)胞、CD4+CD25+T細(xì)胞的百分率比較(%，s)

表1 各組大鼠治療后血CD4+T細(xì)胞、CD4+CD25+T細(xì)胞的百分率比較(%，s)

與對(duì)照組比較：1)P ＜0.05，2)P ＜0.01;與模型組比較：3)P ＜0.01

組別 n CD4+T CD4+CD25+T LEF大劑量組 12 36.18±1.901)3) 3.44±0.052)3)12 33.31±2.31 3.75±0.06 LEF小劑量組 12 42.07±1.692)3) 2.31±0.111)2)甲潑尼龍組 12 43.12±2.492)3) 2.31±0.051)2)模型組 14 46.47±2.182) 2.20±0.042)對(duì)照組

3 討論

EAE是在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物發(fā)生的、局限于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的自身免疫反應(yīng)，是CD4+T細(xì)胞介導(dǎo)的以特異性攻擊髓鞘的自身抗原引起神經(jīng)髓鞘損傷為特點(diǎn)的神經(jīng)系統(tǒng)免疫性疾病。EAE具有與人類(lèi)MS極為相似的病理學(xué)、免疫學(xué)和臨床特征，成為研究MS的理想動(dòng)物模型。國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)EAE模型進(jìn)行了較多研究〔7〕。本實(shí)驗(yàn)造模成功后腦脊髓組織切片HE染色可見(jiàn)急性血管炎伴周?chē)枨拭撌?，小靜脈周?chē)写罅垦准?xì)胞浸潤(rùn)，形成血管鞘，白質(zhì)多于灰質(zhì)，與國(guó)內(nèi)外報(bào)道基本一致。

MS現(xiàn)在多用糖皮質(zhì)激素作為急性發(fā)作期的治療，但短期應(yīng)用激素對(duì)MS長(zhǎng)期功能恢復(fù)并無(wú)明顯療效。環(huán)孢素、氨甲蝶呤、硫唑嘌呤對(duì)進(jìn)展型MS很可能有一定治療作用，但長(zhǎng)期應(yīng)用副作用較大。免疫球蛋白靜滴治療可縮短病程、加速神經(jīng)功能恢復(fù)，但價(jià)格昂貴，且對(duì)多次復(fù)發(fā)者和進(jìn)展型MS效果不理想。在MS發(fā)病機(jī)制及病情演化中，細(xì)胞免疫與體液免疫均參與了病理免疫過(guò)程，免疫異常及免疫細(xì)胞的網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)是其發(fā)病的機(jī)制，因此應(yīng)用免疫抑制類(lèi)藥物是MS治療的主要手段。

LEF是一種新型免疫抑制劑，其免疫抑制作用機(jī)制主要表現(xiàn)在兩個(gè)方面：(1)抑制嘧啶的從頭合成途徑，阻斷淋巴細(xì)胞的活化和增殖過(guò)程。LEF通過(guò)抑制嘧啶從頭合成途徑的關(guān)鍵酶-二氫乳清酸脫氫酶來(lái)阻斷嘧啶的從頭合成途徑〔8〕。(2)抑制酪氨酸激酶的活性，阻斷細(xì)胞炎癥信號(hào)的級(jí)聯(lián)傳導(dǎo)過(guò)程〔9〕。鑒于上述兩種獨(dú)特的作用機(jī)制，國(guó)外許多學(xué)者將該藥稱(chēng)為“雙重作用免疫抑制劑”。另外，許多基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)還表明，LEF還能夠直接抑制抗體的產(chǎn)生〔10〕，抑制核轉(zhuǎn)錄因子NF-JB的活化等。LEF對(duì)多種自身免疫性疾病和免疫介導(dǎo)性疾病有確切的療效和良好的安全性，在風(fēng)濕病、腎臟病、皮膚病、器官移植領(lǐng)域有廣闊的臨床應(yīng)用前景。LEF的不良反應(yīng)主要表現(xiàn)為脫發(fā)、胃腸道反應(yīng)，但發(fā)生率較低，且程度較輕，表明LEF治療免疫性疾病是安全的，且相對(duì)于環(huán)孢素A、霉酚酸酯等而言，費(fèi)用較低，能被大多數(shù)患者所接受，不失為經(jīng)一線免疫抑制劑治療無(wú)效患者的一種選擇。

CD4+CD25+T細(xì)胞是一類(lèi)調(diào)節(jié)性細(xì)胞，是在胸腺細(xì)胞正常分化時(shí)由CD4+CD8+雙陽(yáng)性細(xì)胞向CD4+CD8－單陽(yáng)性細(xì)胞轉(zhuǎn)變過(guò)程中形成的，在抑制自身反應(yīng)性細(xì)胞增殖、維持免疫環(huán)境的穩(wěn)定方面起著重要作用。CD4+CD25+T細(xì)胞數(shù)量的減少、抑制功能的受損和(或)表面分子表達(dá)的缺陷，都可能導(dǎo)致自身免疫病的發(fā)生。Walker等〔11〕報(bào)道清除CD4+CD25+T細(xì)胞將導(dǎo)致大鼠發(fā)生自身免疫性疾病，推測(cè)可能是由于CD4+CD25+T細(xì)胞的減少導(dǎo)致EAE的發(fā)生。CD4+CD25+T細(xì)胞的免疫抑制機(jī)制主要有以下三種：(1)通過(guò)細(xì)胞接觸發(fā)揮抑制作用。這種抑制需要細(xì)胞表面的T細(xì)胞受體(TCR)活化，然后通過(guò)細(xì)胞表面的MHC分子進(jìn)行直接抑制或通過(guò)抑制抗原提呈細(xì)胞(APC)表達(dá)協(xié)同刺激分子而進(jìn)行間接抑制。(2)通過(guò)分泌抑制性細(xì)胞因子如IF-4、IF-10、TGF-β等發(fā)揮抑制作用。(3)通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性抑制，效應(yīng)性T細(xì)胞與調(diào)節(jié)性T細(xì)胞通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)實(shí)現(xiàn)二者數(shù)量及功能上的動(dòng)態(tài)平衡，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞可抑制效應(yīng)性T細(xì)胞由于抗原刺激引起的增殖，若抑制失敗則會(huì)發(fā)生MS等自身免疫性疾病，CD4+CD25+T細(xì)胞可協(xié)調(diào)這種動(dòng)態(tài)平衡。近年來(lái)，Hori等〔12〕發(fā)現(xiàn)叉頭狀轉(zhuǎn)錄因子Foxp3在CD4+CD25+T細(xì)胞特異性表達(dá)，在CD4+CD25+T細(xì)胞的發(fā)育上起很重要的作用，無(wú)Foxp3的表達(dá)就沒(méi)有CD4+CD25+T細(xì)胞。Huan等〔13〕的研究證實(shí)MS患者的外周CD4+CD25+T細(xì)胞中Foxp3在信使RNA及蛋白水平上均有異常，這種細(xì)胞對(duì)機(jī)體的免疫抑制功能減退與其數(shù)量的衰減呈相關(guān)性，F(xiàn)oxp3水平的降低通過(guò)CD4+CD25+T細(xì)胞表現(xiàn)為機(jī)體免疫調(diào)節(jié)的功能障礙，這可能與MS直接相關(guān)。

本研究證明LEF作為一種免疫調(diào)節(jié)劑可以抑制CD4+T淋巴細(xì)胞增殖，降低CD4+T淋巴細(xì)胞百分?jǐn)?shù)，同時(shí)可誘導(dǎo) CD4+CD25+T細(xì)胞百分?jǐn)?shù)增加，其機(jī)制可能與細(xì)胞間直接接觸及抑制性細(xì)胞因子IL-10、TGF-β等的參與有關(guān)，也可能是通過(guò)激活轉(zhuǎn)錄因子Foxp3，增強(qiáng)CD4+CD25+T細(xì)胞活性來(lái)實(shí)現(xiàn)的，具體機(jī)制有待進(jìn)一步闡明。

1 Hafler DA，Slavik JM，Anderson DE，et al.Multiple Sclerosis〔J〕.Immunol Rev，2005;204(4)：208-31.

2 Diab A，Deng C，Smith JD，et al.Peroxisome proliferator-activated receptor-gamma agonist 15-deoxy-Delta(12，14)-prostaglandin J(2)ameliorates experimental auto-immune encephalomyelitis〔J〕.Immunol，2002;168(5)：2508-15.

3 Nakamura K，Kitani A，Strober W.Cell contact-dependent immunosuppression by CD4(+)CD25(+)regulatory T cells mediated by cell surface-bound transfor-ming growth factor beta〔J〕.J Exp Med，2001;194(5)：629-44.

4 Smolen JS，Kalden JR，Scott DL，et al.Efficacy and safety of leflunomide compared with placebo and sulphasalazine in active rheumatoid arthritis：a double blind，randomized，multicentre trial〔J〕.Lancet，1999;35(3)：259-63.

5 Williums JW，Mital D，Chong A，et al.Experiences with leflunomide in solid organ transplantation〔J〕.Transplantation，2002;73(3)：358-66.

6 Goldblum R.Therapy of rheumatoid arthritis with mycophenolate mofetil〔J〕.Clin Exp Rheumatol，1993;11(suppl 8)：117-9.

7 Swanborg RH.Experimental autoimmune encephalomyelitis in rodents as a mod-el for human demyelinating disease〔J〕.Clin Immunol Immunopathol，1995;77(1)：4-13.

8 Cherwinski HM，Byars N，Ballaron SJ，et al.Leflunomide interferes with pyramidine nucleotide biosynthesis〔J〕.InflammRes，1995;44(8)：317-24.

9 Xu X，Williams JW，Gong H，et al.Two activeties of the immunosuppressive metabolite of leflunomide，A771726.Inhibition of pyrimidine nucleotide synthesis and protein tyrosine phosphorylation〔J〕.Biochem Pharmacol，1996;52(4)：527-33.

10 Xu X，Shen J，Mall JW，et al.In vitro and in vivo antitumor activity of a novel immunomodulatory drug，leflunomide：mechanisms of action〔J〕.Biochem Pham-acol，1999;58(9)：1405-550.

11 Walker LSK，Abbas AK.The enemy within：keeping self-reactive T cells at bay in the periphery〔J〕.Nat Rev Immunol，2002;2(1)：9-11.

12 Hori S，Nomura T，SaKaguchi S.Control of regulatory T cell development by the transcription factor Foxp3〔J〕.Science，2003;299(5609)：1057-61.

13 Huan J，Culbertson N，Spencer L，et al.Decreased Foxp3 levels in multiple sclerosis patients〔J〕.J Neurosci Res，2005;81(1)：45-52.