曲義坤 丁 隆 劉偉新 夏偉濱 (佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154002)

槲寄生(Viscum)為桑寄生科(Lorantheceae)半寄生常綠小灌木，常寄生于?？啤⒉杩?、山毛茛科、蕓香料、薔薇科和豆科等29科50余種植物上〔1〕。該屬植物有30多個(gè)種，我國(guó)分布11個(gè)種，在我國(guó)大部分省區(qū)都有分布，其中有4種寄生在桑樹(shù)上〔2～4〕。槲寄生中含有多種活性成分，現(xiàn)已從中分離得到揮發(fā)油、黃酮、有機(jī)酸等小分子化合物以及多肽、蛋白、多糖等高分子化合物。另?yè)?jù)報(bào)道，槲寄生的總生物堿具有較強(qiáng)的抗腫瘤作用，是槲寄生中有效的抗腫瘤成分之一，但是未見(jiàn)國(guó)內(nèi)有關(guān)從槲寄生中分離生物堿的報(bào)道〔5〕。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 儀器設(shè)備 DG5O31型酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(德國(guó));UV757CRT紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海玉田分析儀器公司);電子分析天平(上海恒平科學(xué)儀器有限公司);HH.CP-T型二氧化碳培養(yǎng)箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司);Olympus倒置熒光顯微鏡(CKX41);VS-1300U超凈工作臺(tái) (VS-1300U);96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(Gibco公司)。

1.1.2 試劑 槲寄生生物堿(Sigma公司);DMEM培養(yǎng)基、優(yōu)級(jí)胎牛血清;DMSO(Gibco公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 藥品的配制 稱(chēng)取槲寄生生物堿5 mg溶于2 ml DMSO中，得濃度均為2.5 mg/ml的儲(chǔ)備溶液。取儲(chǔ)備溶液適量，用DMSO配制一系列不同濃度的藥液，4℃ 保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 槲寄生生物堿對(duì)癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

1.2.2.1 細(xì)胞分組 將經(jīng)處理待分組的細(xì)胞分為給藥組和對(duì)照組兩組。給每個(gè)藥物加藥組均各設(shè)6個(gè)作用時(shí)間，每個(gè)作用時(shí)間設(shè)3個(gè)平行樣品。對(duì)照組共設(shè)6個(gè)作用時(shí)間，每個(gè)作用時(shí)間設(shè)3個(gè)平行樣品。

1.2.2.2 給藥實(shí)驗(yàn) 給藥組細(xì)胞分別加相應(yīng)的藥物儲(chǔ)備液20 μl，使藥物的終濃度均為60 μmol/L。對(duì)照組細(xì)胞每皿加DMSO 20 μl。細(xì)胞放回培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，分別于第 0，1，2，3，4，5，6小時(shí)，分別取出加藥組和對(duì)照組細(xì)胞各3皿，分別收集其細(xì)胞質(zhì)并進(jìn)行循環(huán)伏安測(cè)定。

1.2.2.3 MTT測(cè)定 將96孔板放回培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，每孔加入20 μl的MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)，小心吸除培養(yǎng)上清液，然后每孔加入DMSO 150 μl并充分震蕩，充分溶解藍(lán)紫色沉淀后，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定每孔在波長(zhǎng)490 nm處的吸光度值(A)。

1.2.3 MTT法研究槲寄生生物堿的作用劑量對(duì)癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

1.2.3.1 細(xì)胞的處理及分組 將狀態(tài)良好且長(zhǎng)滿的MCF-7細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶消化至細(xì)胞間隙清晰，加入適量DMEM培養(yǎng)液吹打懸浮，用培養(yǎng)液調(diào)細(xì)胞濃度為1.0×105cells/ml，用移液槍從此同一細(xì)胞懸液中移取細(xì)胞懸液各200 μl接種至96孔板內(nèi)，培養(yǎng)過(guò)夜后將其分為對(duì)照組和加藥組兩組。加藥組設(shè)6個(gè)作用劑量，每個(gè)作用劑量設(shè)3個(gè)復(fù)孔。對(duì)照組共設(shè)3孔。

1.2.3.2 給藥實(shí)驗(yàn) 稱(chēng)取MTT粉末5 mg充分溶于1 ml pH 7.4 PBS中得濃度為5 mg/ml的MTT溶液。加藥組細(xì)胞分別加相應(yīng)的不同濃度的藥物加藥溶液10 μl/孔，并使每種藥物加藥組的 加 藥 終 濃 度 分別 均為：0，5，10，20，40，80，100，120 μmol/L。對(duì)照組加 DMSO 10 μl/孔。

1.2.3.3 MTT測(cè)定 將96孔連續(xù)培養(yǎng)24 h后，每孔加入20 μmol/L的MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)，吸除培養(yǎng)上清液，然后每孔加入DMSO 150 μl，充分震蕩，溶解藍(lán)紫色沉淀后，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定每孔在波長(zhǎng)490 nm處的吸光度值(A)。

1.3 數(shù)據(jù)處理 按公式：細(xì)胞毒效應(yīng) =(A對(duì)照組－A給藥組)/A對(duì)照組。A對(duì)照組是對(duì)照孔的吸光度;A給藥組是給藥孔的吸光度。計(jì)算槲寄生生物堿各作用劑量對(duì)胃癌細(xì)胞的細(xì)胞毒效應(yīng)，用Origin 8.0軟件求算IC50。計(jì)量資料數(shù)據(jù)用s表示，做方差分析，組間做t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 槲寄生生物堿對(duì)癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響結(jié)果 表1可見(jiàn)，MTT法測(cè)定不同劑量下對(duì)胃癌細(xì)胞的抑制率。劑量小于40 μmol/L時(shí)，隨著劑量的增加，對(duì)細(xì)胞的抑制率明顯增長(zhǎng)，幾乎成直線增長(zhǎng);劑量在40～120 μmol/L時(shí)，細(xì)胞抑制率雖然也隨劑量的增加而增長(zhǎng)，但速度較慢，曲線趨勢(shì)較平緩。說(shuō)明在這個(gè)區(qū)間內(nèi)槲寄生生物堿的細(xì)胞毒作用接近最大的飽和狀態(tài)。MTT法得到的細(xì)胞抑制率的最高值為79.2%。

2.2 MTT法研究槲寄生生物堿的作用劑量對(duì)癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響 表1可見(jiàn)，槲寄生生物堿對(duì)胃癌細(xì)胞的抑制作用具有劑量依賴性。當(dāng)槲寄生生物堿劑量在20 μmol/L以下時(shí)，隨著劑量的增加，細(xì)胞的響應(yīng)電流的兩個(gè)信號(hào)都呈直線形下降，變化非常顯著。當(dāng)槲寄生生物堿的劑量在20～120 μmol/L時(shí)，隨著劑量的增加，細(xì)胞的響應(yīng)電流的兩個(gè)信號(hào)也下降，但變化幅度比較小。從兩個(gè)信號(hào)的趨勢(shì)上看，它們的走勢(shì)是一致的，說(shuō)明在槲寄生生物堿的劑量依賴性上，兩個(gè)信號(hào)都能用于很好的描述。在高劑量≥10－5μmol/L時(shí)，表現(xiàn)為對(duì)胃癌細(xì)胞的抑制作用;而在低劑量下＜10－5μmol/L時(shí)，表現(xiàn)為對(duì)胃癌細(xì)胞的促進(jìn)增殖作用。本實(shí)驗(yàn)在10×10－6μmol/L～120×10－6μmol/L劑量范圍內(nèi)，槲寄生生物堿對(duì)胃癌細(xì)胞明顯抑制。

表1 槲寄生生物堿劑量與MTT法吸光率的關(guān)系( s ，n=3)

表1 槲寄生生物堿劑量與MTT法吸光率的關(guān)系( s ，n=3)

作用劑量(μmol/L)吸光度 細(xì)胞毒效應(yīng)(%)1.135±0.012 0 5 1.059±0.015 14.6 10 0.845±0.012 31.1 20 0.730±0.013 43.5 40 0.476±0.014 63.2 80 0.325±0.009 70.9 100 0.302±0.013 75.3 0 120 0.242±0.014 79.2

3 討論

從抑制率來(lái)看，槲寄生生物堿對(duì)胃癌細(xì)胞的抑制作用有平臺(tái)期。槲寄生生物堿對(duì)細(xì)胞抑制作用隨給藥培養(yǎng)時(shí)間的變化曲線，可見(jiàn)兩個(gè)信號(hào)所表示的抑制趨勢(shì)是一致的。即培養(yǎng)4 d前，隨著時(shí)間的增加其抑制率明顯增長(zhǎng);在培養(yǎng)4～5 d時(shí)，抑制率達(dá)到最大的平臺(tái)期;培養(yǎng)5 d后，抑制率隨時(shí)間增長(zhǎng)而下降但是抑制率相差較多。平臺(tái)期后抑制率下降的原因可能是因?yàn)榇藭r(shí)對(duì)照組細(xì)胞因?yàn)樯L(zhǎng)空間的限制而不再增殖，出現(xiàn)衰退現(xiàn)象。因此，給藥培養(yǎng)的最佳時(shí)間為4～5 d，此時(shí)細(xì)胞處于營(yíng)養(yǎng)和空間充足狀態(tài)，槲寄生表現(xiàn)出最大的抑制細(xì)胞生長(zhǎng)作用。

1 孫艷秋，劉 珂，王守愚，等.槲寄生的研究進(jìn)展〔J〕.中草藥，2000;31(6)：471-4.

2 陶明煊，吳國(guó)榮.槲寄生的研究與開(kāi)發(fā)利用〔J〕.中國(guó)野生植物資源，2001;20(6)：14-5.

3 孔德云，羅思齊，李惠庭，等.槲寄生化學(xué)成分的研究Ⅰ〔J〕.醫(yī)藥工業(yè)，1987;18(3)：123-7.

4 孔德云，羅思齊，李惠庭，等.槲寄生化學(xué)成分的研究Ⅲ：槲寄生新苷Ⅲ，Ⅴ，Ⅵ的結(jié)構(gòu)〔J〕. 化學(xué)學(xué)報(bào)，1988;23(8)：593-600.

5 Beret A，Cazenave JP.Plant Flavonoids in biology and medicine〔M〕.New York：Elsevier Science，1988：187-200.