張亞麗 李 伶 楊剛毅 盧春敏

(重慶醫(yī)科大學(xué)檢驗系臨床生化教研室 教育部臨床檢驗診斷學(xué)重點實驗室，重慶 400016)

Visfatin是2004年新發(fā)現(xiàn)的脂肪細胞因子，由內(nèi)臟脂肪分泌而得名，與此前發(fā)現(xiàn)的前B細胞克隆增強因子(PBEF)，煙酰胺磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(Nampt)都是同一種物質(zhì);研究發(fā)現(xiàn)Visfatin能夠結(jié)合并調(diào)節(jié)胰島素受體，具有胰島素樣作用，可以降低小鼠血漿葡萄糖水平，但其作用位點又不同于胰島素〔1〕。為了全面評估Visfatin在脂代謝中所起的作用，本研究運用RNA干擾技術(shù)，通過構(gòu)建Visfatin-shRNA表達載體特異性地抑制細胞內(nèi)Visfatin基因表達，建立了Visfatin基因缺陷細胞模型，觀察了這種情況下細胞內(nèi)脂代謝相關(guān)基因的表達變化并分析其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料 小鼠前脂肪細胞3T3-L1(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院上海細胞庫);Hepa1-6細胞(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)細胞中心);OPTI-MEM、DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(美國 Gibco公司);小牛血清(杭州四季青公司);LipofectamineTM2000、PCR引物(美國 Invitrogen公司);RNA提取試劑和SYBR@Premix Ex TaqTMⅡRT-PCR試劑盒、限制性內(nèi)切酶、寡核苷酸片段等(Takara公司);質(zhì)粒小抽試劑盒、膠回收試劑盒(美國O-mega公司);質(zhì)粒大抽試劑盒(去內(nèi)毒素)(北京天根生化科技公司);大腸桿菌 DH5α(本課題組保存);pGenesil-1.2質(zhì)粒和pGenesil-HK質(zhì)粒(武漢晶賽生物工程技術(shù)有限公司);油紅O(美國Sigma公司);兔抗小鼠β-actin一抗、HRP標記的羊抗兔IgG二抗(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司);兔抗小鼠Visfatin一抗(Abcam公司);熒光定量PCR儀(美國Bio-rad公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及誘導(dǎo)分化 將313-L1前脂肪細胞接種于6孔板，待細胞生長融合2 d后先以3-異丁基-1-甲基黃嘌呤+地塞米松+胰島素誘導(dǎo)2 d，再單獨以胰島素誘導(dǎo)2 d后，10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基維持培養(yǎng)2 d，大部分細胞分化為成熟脂肪細胞，即可用于實驗。3T3-L1細胞培養(yǎng)及傳代：37℃，5%CO2條件下，使用含10%小牛血清的 DMEM培養(yǎng)基(含雙抗)培養(yǎng)細胞，當(dāng)細胞生長至70%左右即可進行細胞傳代。Hepa1-6細胞培養(yǎng)及傳代：37℃，5%CO2，DMEM+10%FBS+100 IU雙抗進行常規(guī)細胞培養(yǎng)，當(dāng)細胞鋪滿培養(yǎng)瓶底90%左右時即可傳代。

1.2.2 pGenesil-visfatin重組質(zhì)粒的構(gòu)建與篩選 根據(jù)shRNA設(shè)計原則，設(shè)計并合成6條寡核苷酸片段，將合成的片段分別退火連接并稀釋，pGenesil-1.2質(zhì)粒經(jīng)Eco311酶切線性化后與稀釋片段連接，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細菌后挑單克隆質(zhì)粒小抽，經(jīng)酶切、測序鑒定正確后，用去內(nèi)毒素的質(zhì)粒大抽試劑盒抽提備用。鑒定正確的重組質(zhì)粒分別命名為：pGenesil-visfatin1，2，3。選擇易于培養(yǎng)的Hepa1-6細胞進行篩選，分別對轉(zhuǎn)染48，72，96 h后shRNA對Visfatin基因的抑制效果進行比較，選取抑制效果最佳的重組質(zhì)粒，命名為pGenesil-Visfatin，然后在誘導(dǎo)分化成熟的脂肪細胞中驗證shRNA的有效性。

1.2.3 細胞分組及轉(zhuǎn)染 將誘導(dǎo)分化成熟的313-L1脂肪細胞和Hepa1-6細胞分別分為3組，即空白對照組(無質(zhì)粒組)，陰性對照組(轉(zhuǎn)染 pGenesil-HK組)，干擾組(轉(zhuǎn)染pGenesil-visfatin組)，每組設(shè)平行實驗復(fù)孔(3孔)，將質(zhì)粒和脂質(zhì)體按1∶2.5的比例與Opti-MEM混合后進行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染方法按LipofectamineTM2000說明書。

1.2.4 Visfatin蛋白表達檢測 采用Western印跡法檢測各組細胞Visfatin蛋白表達水平。提取各組細胞總蛋白，按每泳道加80 μg蛋白進行SDS-PAGE電泳，濕轉(zhuǎn)至PVDF膜，室溫封閉3 h，一抗(內(nèi)參 β-actin 1∶100，Visfatin 1∶250 稀釋)4℃孵育過夜，二抗(1∶2 000稀釋)37℃孵育l h并洗脫，將PVDF膜置于化學(xué)發(fā)光板，加入發(fā)光試劑，室溫反應(yīng)2 min后置化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)成像。

1.2.5 Visfatin、脂代謝相關(guān)基因mRNA表達水平檢測 轉(zhuǎn)染48 h后，收集各組細胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。采用SYBR Green l熒光染料實時定量PCR法檢測Visfatin以及脂代謝相關(guān)基因：過氧化物酶增殖物激活受體 α/γ(PPARα/γ)、激素敏感性脂肪酶(HSL)、脂肪組織甘油水解酶(ATGL)、脂肪酸結(jié)合蛋白(AP2)、固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白 1/2(SREBP1/2)、脂肪酸合成酶(FAS)、乙酰輔酶 A羧化酶(ACC)、β羥-β甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶(HMGCR)、低密度脂蛋白受體(LDLr)、甘油三酯(TG)mRNA的表達。以β-actin為內(nèi)參，用2－△△Ct值表示目的基因的相對表達量。所用引物序列略。

1.2.6 脂質(zhì)積聚實驗 采用油紅O染色比色法檢測各組3T3-L1細胞內(nèi)脂質(zhì)積聚變化，即先吸去各孔內(nèi)培養(yǎng)基，用PBS輕洗細胞3次，每孔加入適量10%中性甲醛固定1 h，PBS輕洗3次，晾干，加入新鮮配制的油紅O工作液染色30 min，去離子水洗3次，待完全干燥后，加入1 ml異丙醇洗脫10 min，收集各孔洗脫液于490 nm比色，每孔測定3次，記錄各組OD值。

2 結(jié)果

2.1 Visfatin-shRNA表達載體構(gòu)建和鑒定 重組質(zhì)粒pGenesil-Visfatin1，2，3經(jīng)SacI酶切，均能切出一條約 625 bp的片段(圖1)，證明shRNA片段已成功插入到載體pGenesil-1.2中。酶切小片段測序結(jié)果與所設(shè)計片段序列一致，說明插入片段堿基序列正確。表明 Visfatin-shRNA表達載體 pGenesil-Visfatin1，2，3 構(gòu)建成功。

2.2 Visfatin-shRNA最佳抑制片段的篩選與驗證 轉(zhuǎn)染Hepa1-6細胞后，實時熒光定量PCR檢測各組細胞Visfatin mRNA表達情況，以空白對照組 Visfatin mRNA表達量為1，pGenesil-Visfatin1，2，3對 Visfatin mRNA的抑制率分別為：44.9%，59.4%，71.9%(P均＜0.001)。并且pGenesil-Visfatin3轉(zhuǎn)染后72 h的抑制效果最好，故將pGenesil-Visfatin3命名為 pGenesil-Visfatin，其寡核苷酸片段序列為 GCGCTTTGCTACAGAAGTTAA。將轉(zhuǎn)染后72h作為檢測時間，進一步在脂肪細胞中驗證其有效性，shRNA轉(zhuǎn)染組脂肪細胞Visfatin mRNA表達顯著低于空白對照約70.5%(P＜0.001)，表明該質(zhì)粒能有效抑制脂肪細胞中Visfatin基因表達。

2.3 Visfatin蛋白水平檢測 shRNA轉(zhuǎn)染組細胞Visfatin蛋白表達較空白對照組與陰性對照組均明顯降低，從蛋白水平驗證了Visfatin基因抑制細胞模型構(gòu)建成功。見圖2。

2.4 Visfatin基因表達抑制對細胞脂代謝相關(guān)基因的影響在脂肪細胞，轉(zhuǎn)染pGenesil-Visfatin組與空白對照組相比，脂質(zhì)合成相關(guān)基因 SREBP1，F(xiàn)AS，ACC表達分別降低 17.7%，51.1%和 10.5%，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子PPARα，PPARγ分別降低 40.5%，11.1%;脂質(zhì)分解相關(guān)基因HSL，ATGL，AP2分別降低約 44.5%，23.2%，52.1%，均有統(tǒng)計學(xué)意義。在Hepa1-6細胞，脂質(zhì)合成相關(guān)基因SREBP1降低50.3%，F(xiàn)AS降低32.2%(二者 P＜0.001)，ACC降低 12.9%(P＞0.05);轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子 PPARαmRNA降低 22.6%(P＜0.001)，脂質(zhì)分解相關(guān)基因HSL及 ATGL mRNA水平變化則不具有統(tǒng)計學(xué)意義;膽固醇代謝相關(guān)基因SREBP2，HMGCR，LDLr分別降低22.1%，26.3%，51.0%(P＜0.001)。

圖1 pGenesil-Visfatin1，2，3重組質(zhì)粒的酶切鑒定

2.5 Visfatin基因表達抑制對脂肪細胞內(nèi)TG含量的影響 油紅O染色法對脂肪細胞內(nèi)TG含量在Visfatin基因表達抑制前后的變化進行半定量分析，通過比較發(fā)現(xiàn)，Visfatin基因干擾組脂肪細胞內(nèi) TG含量較空白對照組有輕微降低(0.862±0.016 vs0.878±0.024)，但不具有統(tǒng)計學(xué)意義。

圖2 脂肪細胞Visfatin蛋白電泳圖和Hepa1-6細胞Visfatin蛋白電泳圖

3 討論

PPARs是一種配體激活轉(zhuǎn)錄因子，在調(diào)節(jié)細胞分化和能量平衡中發(fā)揮重要作用〔2〕。PPARs 包括 PPARα、PPARβ/δ、PPARγ三種亞型。PPARα主要表達于脂肪酸分解代謝旺盛的組織，能刺激脂肪酸攝取和活化、脂肪酸氧化等〔3〕;PPARγ主要存在于脂肪組織，是細胞分化和脂質(zhì)積累所必需的調(diào)節(jié)因子〔4〕;PPARβ/δ分布廣泛，本研究未對其進行檢測。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)Visfatin過表達可增加大鼠脂肪組織PPARγ mRNA表達〔5〕，本研究表明 Visfatin基因表達下調(diào)導(dǎo)致了這兩個轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子表達的降低，這將進一步影響其對靶基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)，并對脂代謝產(chǎn)生影響。HSL和ATGL是脂肪分解的限速酶，二者都是PPARα的靶基因，AP2是高表達于脂肪細胞的一種蛋白，它與 HSL結(jié)合并增加其脂解活性〔6〕。在脂肪細胞Visfatin基因抑制組，HSL、ATGL、AP2 mRNA表達也明顯降低，表明Visfatin對脂解相關(guān)基因具有調(diào)節(jié)作用，這種作用可能是通過改變其上游轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子PPARα基因表達來實現(xiàn)的。在肝細胞中HSL與ATGL的變化不具統(tǒng)計學(xué)差異，其原因可能是肝細胞中PPARα受Visfatin基因表達的影響較脂肪細胞中小。因此我們認為Visfatin基因表達下調(diào)對脂肪分解產(chǎn)生了一定的影響。

SREBPs是調(diào)節(jié)脂肪酸和膽固醇代謝的關(guān)鍵核轉(zhuǎn)錄因子，有3種形式SREBP-la、SREBP-1c和 SREBP-2。SREBP-1c主要調(diào)控脂肪酸生物合成通路的基因表達;SREBP2則主要調(diào)節(jié)膽固醇攝取和合成相關(guān)的基因表達〔7〕。本研究可觀察到在Visfatin基因抑制組，SREBP1c，SREBP2 mRNA表達較對照組都有明顯降低。FAS和ACC是調(diào)節(jié)脂肪酸內(nèi)源性合成的酶類，二者都是脂肪酸合成的關(guān)鍵酶〔8〕。FAS在新生脂質(zhì)合成中處于中心地位，其活性改變主要是因為基因本身的轉(zhuǎn)錄發(fā)生改變〔9〕;ACC則催化丙二酰CoA的合成反應(yīng)，丙二酰CoA是 FAS發(fā)揮作用以及脂肪鏈延伸不可缺少的底物〔10〕。本研究中，F(xiàn)AS和ACC mRNA表達在Visfatin基因干擾組都有明顯下降，可能與SREBP1基因表達下降有關(guān)，因為二者都是SREBP1調(diào)控的靶基因〔7〕。因此，Visfatin基因表達下調(diào)可能會使脂肪酸合成反應(yīng)受到抑制。

對脂肪細胞進行油紅O染色顯示，Visfatin基因抑制組TG含量較對照組輕微降低，但不具有統(tǒng)計學(xué)意義，其原因可能是Visfatin基因的改變導(dǎo)致主導(dǎo)TG代謝上游的某個(或幾個)基因產(chǎn)生變化，從而使整個TG代謝受到一定的影響，其具體作用機制有待進一步的深入研究。微粒體酶HMGCR是膽固醇合成的限速酶，而膽固醇攝取主要是通過LDLr途徑完成的。研究發(fā)現(xiàn)在大鼠體內(nèi)過表達 Visfatin可導(dǎo)致 SREBP2，HMGCR mRNA表達明顯升高〔5〕。本研究表明肝細胞合成膽固醇及通過LDLr途徑攝取膽固醇的能力降低，可能是由于通過抑制SREBP2的表達，使其激活下游靶基因的能力降低，最終導(dǎo)致細胞對膽固醇的代謝降低;或者是因為使細胞內(nèi)膽固醇含量增加，而膽固醇對HMGCR及LDLr都具有負反饋調(diào)節(jié)作用，所以導(dǎo)致兩種基因表達的下調(diào)。

綜上所述，通過本研究，我們認為Visfatin基因抑制可能通過改變主導(dǎo)TG代謝上游的某個(或幾個)基因產(chǎn)生變化，從而使整個TG代謝受到的影響，同時能調(diào)節(jié)膽固醇代謝，其對活體內(nèi)脂代謝的影響及作用機制尚需進一步的研究。

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