羅 榮，趙江平，胡 超，程國(guó)鋒

日本血吸蟲病為人獸共患寄生蟲病，危害嚴(yán)重，是我國(guó)最重要的公共衛(wèi)生問(wèn)題之一。雖然半個(gè)多世紀(jì)來(lái)，我國(guó)血吸蟲病防治取得了重大成就，但防治形勢(shì)仍然很嚴(yán)峻[1－2]。

盡管血吸蟲面對(duì)宿主的免疫排斥和對(duì)抗，仍可在終末宿主體內(nèi)存活數(shù)年，推測(cè)蟲體細(xì)胞生死存活調(diào)控可能具有一定的特殊性[3－4]。凋亡作為細(xì)胞內(nèi)程序性的有序死亡，是生命體維持自身生長(zhǎng)發(fā)育、病理及生理性反應(yīng)的重要方式。凋亡抑制因子作為細(xì)胞凋亡調(diào)控的負(fù)因子，已引起了有關(guān)學(xué)者的關(guān)注。在日本血吸蟲中，已有凋亡負(fù)調(diào)控相關(guān)的因子SjBcl－2／1、SjBcl－2／2、SjA[3]、SjIAP[4]和Sj－CIAP[5]等研究報(bào)道。我們實(shí)驗(yàn)室的前期研究發(fā)現(xiàn)日本血吸蟲凋亡抑制因子可顯著抑制人HEK293T的凋亡[4]，提示SjIAP在日本血吸蟲的寄生和生長(zhǎng)發(fā)育中可能發(fā)揮重要作用。

為進(jìn)一步研究SjIAP的功能，本研究根據(jù)其cDNA序列設(shè)計(jì)了3對(duì)siRNA分子，首先在HEK293T細(xì)胞中篩選出了最佳siRNA干擾分子，然后利用獲得最佳的siRNA分子對(duì)體外培養(yǎng)的日本血吸蟲蟲體進(jìn)行干擾研究。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和生物材料 新西蘭大耳兔購(gòu)自上海羅涇飛達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖場(chǎng)；BALB／c小鼠購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。日本血吸蟲尾蚴由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所釘螺室提供。利用腹部貼片法將尾蚴感染新西蘭白兔（約3 000條尾蚴／兔）以及BALB／c小鼠（約150條尾蚴／鼠），感染后第12d剖殺動(dòng)物，肝門靜脈灌注法收集血吸蟲蟲體，然后立即進(jìn)行體外培養(yǎng)。培養(yǎng)基組成為：RPMI－1640中加入終濃度10% 胎牛血清（V／V）、100 U／mL青霉素、100μg／mL鏈霉素、0.2%D－葡萄糖（g／V）、0.1% 水解乳蛋白 （g／V）、1μmol／L次黃嘌呤、1μmol／L 5－羥色胺、0.5μmol／L氫化可的松和0.2U／mL胰島素。培養(yǎng)條件：37。C、CO2濃度為5%的細(xì)胞培養(yǎng)箱。

1.2 試劑耗材 RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清、雙抗（青霉素和鏈霉素）購(gòu)自上海世儀生物有限公司；Lipofectamine 2000和Opti－MEM?培養(yǎng)基購(gòu)自Invitrogen公司；Caspase3／7檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Promega公司；抗Tubulin抗體和羊抗兔的IgG－HRP購(gòu)自北京康為世紀(jì)有限公司；氫化可的松、5－羥色胺、次黃嘌呤和胰島素購(gòu)自Sigma公司；Bradford蛋白定量試劑盒購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司；小干擾siRNA分子由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)并化學(xué)合成。

1.3 HEK293T細(xì)胞培養(yǎng) HEK293T細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室惠存，培養(yǎng)液為95%DMEM培養(yǎng)基、5% 胎牛血清、100U／mL青霉素和100μg／mL鏈霉素；培養(yǎng)條件：37。C、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱。待細(xì)胞培養(yǎng)匯合約90%時(shí)，利用胰酶消化細(xì)胞，消化結(jié)束后加入胎牛血清終止反應(yīng)，將消化的細(xì)胞離心并洗滌，加入培養(yǎng)基，在新培養(yǎng)板中進(jìn)行培養(yǎng)。

1.4 質(zhì)粒和SiRNA共轉(zhuǎn)染 首先將A液（50μL Opti－MEM ＋1.5μL Lipofectamine 2000）充分混勻且室溫孵育5min，然后將其轉(zhuǎn)移至B液（50μL Opti－MEM ＋400ng pcDNA3.1（＋）－IAP＋2μL siRNA）中，充分混勻后室溫繼續(xù)孵育20min，然后小心將其加入細(xì)胞培養(yǎng)孔中且搖勻，繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)，48h后收集轉(zhuǎn)染細(xì)胞，分別利用Real time RT－PCR檢測(cè)IAP的轉(zhuǎn)錄水平和免疫印跡檢測(cè)IAP蛋白水平變化。

1.5 日本血吸蟲體外RNA干擾 將收集的日本血吸蟲蟲體用0.5%（w／v）的水解乳蛋白溶液洗滌3次，添加完全培養(yǎng)基于12孔培養(yǎng)板進(jìn)行體外培養(yǎng)，每孔培養(yǎng)基為3mL，蟲體約為25條。實(shí)驗(yàn)共設(shè)：空白組，無(wú)關(guān)對(duì)照組，siRNA－592和siRNA－951處理組，RNA終濃度均為100nmol／L，培養(yǎng)條件如前所述，每12h補(bǔ)加一次RNA。培養(yǎng)72h后，收集蟲體進(jìn)行IAP轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平檢測(cè)。

1.6 Real time RT－PCR 利用Trizol提取轉(zhuǎn)染的HEK293T細(xì)胞或日本血吸蟲蟲體總RNA。將1 μg細(xì)胞或蟲體總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄制備cDNA，將1μL cDNA作為模版，進(jìn)行Real time RT－PCR檢測(cè)IAP轉(zhuǎn)錄水平的變化。反應(yīng)體系為：細(xì)胞或蟲體cDNA 1μL，2×SBYR?Primix Ex TaqTMⅡ7.5 μL，引物0.3μL（SjIAP上游：5′－CGG ATC AAC CTG AAG CGT GT－3′，下游：5′－ATT ACC CCA GGA AGA CCA CG－3’），dH2O 6.2μL。PCR運(yùn)行參數(shù)是：95。C，30s；循環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)為：95。C，5s；60。C，34s，共40個(gè)循環(huán)。分別以人18S核糖體RNA（上游：5′－GAC GGA AGG GCA CCA CCA G－3′ 下 游：5′－ACC AGA CAA ATC GCT CCA CC－3′）和血吸蟲煙酰胺腺嘌呤二核苷酸脫氫酶（上游：5′－CGA GGA CCT AAC AGC AGA GG－3′下游：5′–TCC GAA CGA ACT TTG AAT TC－3′）為內(nèi)參，通過(guò)2－ΔΔCt方法計(jì)算IAP的相對(duì)表達(dá)量。

1.7 免疫印跡分析 利用Bradford法（生工生物工程（上海）股份有限公司）對(duì)HEK293T細(xì)胞和日本血吸蟲蟲體蛋白進(jìn)行定量，將20μg蛋白樣品進(jìn)行電泳（10%SDS－聚丙稀酰胺凝膠）分離，將分離的蛋白電轉(zhuǎn)至硝酸纖維膜（Whatman Germany）上。膜在5%（W／V）脫脂奶粉封閉2h，結(jié)束后，利用PBST（pH＝7.4）對(duì)膜進(jìn)行洗滌。然后，分別將抗IAP抗體（稀釋度為1∶500）和抗Tubulin的抗體與膜共溫育1h，結(jié)束后，用PBST（pH＝7.4）溶液洗3次，每次5min。利用羊抗兔（鼠）IgG－HRP作為二抗，室溫下與硝酸纖維膜孵育30min，然后再用PBST溶液洗3次，每次5min。最后，利用ECL反應(yīng)液進(jìn)行顯色。

1.8 Caspase3／7活性檢測(cè) 利用 Caspase 3／7as－say試劑盒進(jìn)行Caspase 3／7活性測(cè)定，將80μL的蟲體裂解液與80μL Caspase試劑混合。然后，在室溫作用30min。結(jié)束后，取100μL的混合物在熒光酶檢測(cè)儀（Berthold FB 12Luminometer）進(jìn)行測(cè)定。同時(shí)，利用Bradford法進(jìn)行蛋白定量，通過(guò)蛋白濃度對(duì)熒光值進(jìn)行均一化處理。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用T檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 干擾SjIAP的最佳siRNA分子篩選 利用生物信息學(xué)，根據(jù)SjIAP的cDNA序列設(shè)計(jì)3對(duì)siRNA分子（表1），對(duì)其進(jìn)行化學(xué)合成。將體外退火的每對(duì)siRNA分子分別與重組質(zhì)粒pcDNA3.1（＋）－IAP共轉(zhuǎn)染至HEK293T細(xì)胞中。利用Real time RT－PCR分析IAP轉(zhuǎn)錄水平的變化。結(jié)果表明轉(zhuǎn)染siRNA－592和siRNA－951小RNA分子可顯著降低SjIAP的轉(zhuǎn)錄，其中siRNA－951抑制能力最強(qiáng)，可達(dá)79%（圖1）。

表1 日本血吸蟲IAP的siRNAs序列Tab.1 List of the siRNAs used for SjIAP silence

圖1 實(shí)時(shí)定量RT－PCR分析最佳干擾IAP的siRNA分子Fig.1 Real－time RT－PCR analysis of the siRNAs for silencing IAP in HEK293Tcell

2.2 最佳siRNA的蟲體內(nèi)干擾研究 在體外培養(yǎng)的日本血吸蟲童蟲（12d）中分別加入siRNA－951，siRNA－592及無(wú)關(guān)對(duì)照siRNA（終濃度均為100 nmol／L），繼續(xù)培養(yǎng)72h，收集蟲體，檢測(cè)SjIAP轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平表達(dá)情況。結(jié)果表明實(shí)時(shí)RTPCR顯示干擾72h后蟲體SjIAP的轉(zhuǎn)錄水平均沒(méi)有明顯變化（圖2）。進(jìn)一步免疫印跡分析表明siRNA－951處理組可顯著降低蟲體內(nèi)SjIAP的表達(dá)（圖3）。

圖2 實(shí)時(shí)定量RT－PCR分析最佳干擾siRNA分子干擾血吸蟲體內(nèi)IAP的效果Fig.2 Real－time RT－PCR analysis of the siRNAs for silencing IAP in S.japonicum

圖3 免疫印跡分析血吸蟲IAP干擾的效果Fig.3 Western blot analysis of the IAP expression in schistosomes treated by the siRNAs

2.3SjIAP敲降后蟲體Caspase活性測(cè)定 本課題組前期研究表明SjIAP可抑制人HEK293細(xì)胞凋亡的進(jìn)程，Caspase作為細(xì)胞凋亡過(guò)程中重要活性分子，對(duì)此測(cè)定可反映細(xì)胞凋亡的強(qiáng)弱[4－5]。為此，在siRNA處理72h后，對(duì)蟲體內(nèi)的Caspase3／7活性檢測(cè)。結(jié)果表明，與空白對(duì)照組和無(wú)關(guān)對(duì)照組相比，siRNA－951 和 siRNA－592 處 理 組 蟲 體 的Caspase3／7活性有所提高（圖4），提示干擾SjIAP后血吸蟲蟲體細(xì)胞的凋亡可能有所上升。另外，siRNA處理和對(duì)照組的蟲體形態(tài)沒(méi)有明顯區(qū)別。

圖4 日本血吸蟲IAP干擾后Caspase 3／7活性分析Fig.4 Effect of SjIAP silence in schistosomes on Caspase 3／7 activity

3 討 論

研究表明寄生蟲可調(diào)控宿主細(xì)胞的凋亡以維持其寄生[6－7]。日本血吸蟲成蟲通常寄生于終末宿主的腸系膜靜脈內(nèi)，雖然直接面對(duì)來(lái)自宿主血液體統(tǒng)的免疫排斥和對(duì)抗，仍能存活長(zhǎng)達(dá)數(shù)年。因此，深入研究血吸蟲如何調(diào)控自身細(xì)胞的存活的分子機(jī)理并對(duì)其進(jìn)行干預(yù)有可能開拓血吸蟲病防控的新途徑。血吸蟲基因組學(xué)研究表明蟲體內(nèi)存在編碼與高等動(dòng)物類似細(xì)胞凋亡信號(hào)通路。我們課題組前期研究表明血吸蟲IAP蛋白能顯著抑制放線菌素誘導(dǎo)的HEK293T細(xì)胞的凋亡[4]。為進(jìn)一步研究此分子的功能，本研究根據(jù)SjIAP的cDNA序列設(shè)計(jì)了3對(duì)siRNA分子。分別將3對(duì)siRNA分子與表達(dá)SjIAP的重組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到HEK293T細(xì)胞中，實(shí)時(shí)定量RT－PCR和免疫印跡分析表明獲得了2個(gè)干擾效果較好的siRNA分子（siRNA－592和siRNA－951）。然后，將這2個(gè)siRNA分子分別加入到干擾體外培養(yǎng)日本血吸蟲童蟲中（12d），繼續(xù)培養(yǎng)3d，免疫印跡分析表明蟲體內(nèi)SjIAP蛋白表達(dá)有所下降，特別是siRNA－951組尤為明顯。Caspase活性測(cè)定表明在SjIAP敲降后的蟲體中Caspase 3／7活性有所提高，提示蟲體細(xì)胞凋亡進(jìn)行可能有所增強(qiáng)，有待后續(xù)研究深入查明。

免疫印記分析表明干擾后蟲體IAP蛋白的表達(dá)有所降低，但實(shí)時(shí)定量RT－PCR和半定量PCR分析表明其mRNA在轉(zhuǎn)錄水平變化不明顯。我們推測(cè)可能由于SjIAP的mRNA量較高（比內(nèi)參NADH還高），在干擾效果有限的情況下，導(dǎo)致IAP轉(zhuǎn)錄水平干擾效果不明顯。另外，也可能由于siRNA－951分子主要引起IAP蛋白的翻譯抑制，有待進(jìn)一步研究查明。

總之，本研究獲得了2個(gè)干擾SjIAP較好的siRNA分子，為進(jìn)一步利用此分子，研究SjIAP的功能奠定了前期基礎(chǔ)。

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