張海朋，趙 杰#，張莉蓉，王曉飛，薛文華

1)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部 鄭州 450052 2)鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室 鄭州 450001

細(xì)胞色素P450(cytochrome P450,CYP450)是藥物在體內(nèi)代謝的重要酶系，其中CYP3A最為豐富,約占CYP450總量的30%～40%。CYP3A包含CYP3A4、CYP3A5、CYP3A7和CYP3A43四種亞型[1]，其中CYP3A4參與了60%現(xiàn)有藥物的體內(nèi)代謝，是人體藥物代謝的最重要的肝藥酶之一，CYP3A4的代謝數(shù)據(jù)和藥動學(xué)參數(shù)更是新藥臨床前評價所必需的資料[2]。但是由于個體間CYP3A4酶活性可存在5～60倍的差異[3-4]，所以在進(jìn)行CYP3A4酶活性的測定時，須選擇特異性比較好的探針?biāo)幬?。咪達(dá)唑侖(midazolam,MDZ)主要經(jīng)CYP3A4體內(nèi)代謝為1’-OH MDZ，1’-OH MDZ與MDZ的單點血藥濃度之比可反映CYP3A4的酶活性，與眾多的CYP3A4酶底物有著良好的相關(guān)性，是研究體內(nèi)CYP3A4酶活性較理想的探針?biāo)嶽5-6]。作者在文獻(xiàn)基礎(chǔ)上對CYP3A4酶活性的體外孵育HPLC測定方法進(jìn)行了改進(jìn)，對50例肝臟標(biāo)本CYP3A4酶活性進(jìn)行了測定，并對不同性別、年齡、肝膽病變情況與酶活性的強弱進(jìn)行了關(guān)聯(lián)性分析，為進(jìn)一步研究CYP3A4酶活性的個體差異性提供了一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1標(biāo)本來源標(biāo)本取自鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院肝膽外科的住院患者50例，其中男28例，女22例；年齡3～87(43.2±17.5)歲;肝癌21例，肝血管瘤16例，膽組織病變13例?；颊哌M(jìn)行肝膽切除手術(shù)時取邊緣正常的肝臟組織，用準(zhǔn)備好的凍存管裝載包裹，迅速投入液氮(-196 ℃)中冷卻保存。患者均簽署了知情同意書，該研究方案得到鄭州大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理委員會認(rèn)可。

1.2儀器和試劑Agilent 1200高效液相色譜儀和臺式高速低溫離心機D-37520型(德國Heraeus公司)；MDZ標(biāo)準(zhǔn)品、1’-OH MDZ標(biāo)準(zhǔn)品( 北京匯智泰康醫(yī)藥技術(shù)有限公司); NADPH、BCA蛋白濃度測定試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所);甲醇(色譜純)，乙腈(色譜純)，Tris-HCl、K2HPO4、KH2PO4、EDTA、MgCl2、 CaCl2、蔗糖等試劑均為市售分析純，實驗用水為超純水。

1.3溶液的配制

1.3.1 勻漿緩沖液 精密稱取13.92 g K2HPO4，2.72 g KH2PO4，0.037 2 g EDTA，1.016 5 g MgCl2·6H2O，加超純水定容至1 L，用NaOH調(diào)pH至7.4，室溫保存。

1.3.2 洗滌緩沖液 精密量取6.93 mL HCl,12.114 g Tris,1.017 g MgCl2·6H2O，加超純水定容至1 L，用NaOH調(diào)pH至7.4,室溫保存。

1.3.3 蔗糖緩沖液 精密稱取1.392 g K2HPO4，0.272 g KH2PO4，8.558 g蔗糖，加超純水定容至100 mL，制成0.25 mol/L蔗糖緩沖液,室溫保存待用。

1.3.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液 精密稱取0.017 1 g MDZ標(biāo)準(zhǔn)品，加超純水定容至5 mL，制成10 mol/L MDZ標(biāo)準(zhǔn)溶液，-4 ℃條件下保存待用。精密稱取10 μg 1’-OH MDZ標(biāo)準(zhǔn)品，加超純水配制的體積分?jǐn)?shù)50%甲醇溶液定容至1 mL，制成1’-OH MDZ標(biāo)準(zhǔn)溶液，-4 ℃條件下保存待用。

1.4肝微粒體的制備和體外孵育取適量肝組織，用洗滌緩沖液反復(fù)沖洗至土黃色，用濾紙擦干后稱質(zhì)量；每g加入3 mL勻漿緩沖液，充分勻漿；4 ℃，12 500g離心20 min； 取上清液，加CaCl2溶液，混勻，冰浴5 min，輕輕攪拌數(shù)次，27 000g離心20 min；棄上清液，沉淀用洗滌緩沖液洗滌，27 000g離心20 min；棄上清液，沉淀用含蔗糖溶液懸浮均勻；分裝，于-80 ℃保存?zhèn)溆谩２捎肂CA蛋白測定法測定微粒體的蛋白含量。實驗前將所用試劑、用具置于4 ℃預(yù)冷；以上操作均在4 ℃條件下進(jìn)行。孵育體系總體積125 μL，包含EDTA、MgCl2、肝微粒體蛋白適量、MDZ標(biāo)準(zhǔn)品適量，加PBS 補足體系至125 μL，體系中各組分的終濃度分別為EDTA 0.1 mmol/L、MgCl25 mmol/L、肝微粒體蛋白1 g/L。孵育體系在37 ℃水浴中預(yù)孵育5 min后，加入2 g/L NADPH 12.5 μL啟動反應(yīng)，孵育20 min，冰浴終止反應(yīng)。

1.5體外孵育HPLC方法的建立

1.5.1 樣品制備 孵育體系冰浴冷卻終止反應(yīng)后，加入25 μL氫氧化鈉溶液堿化，用1.25 mL乙醚萃取，渦旋混合1 min，3 000 r/min離心10 min，分離1 mL有機層，常溫下氮吹干，取流動相溶解殘留物，13 000 r/min離心后吸上清液40 μL進(jìn)樣。

1.5.2 色譜條件 色譜柱為Angel C-18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動相為甲醇乙腈水(體積比531334),流速為1 mL/min，檢測波長220 nm，柱溫25 ℃，進(jìn)樣量40 μL。

1.5.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 取6支EP管，各加入空白孵育體系，精密吸取1’-OH MDZ標(biāo)準(zhǔn)溶液加流動相稀釋配成終質(zhì)量濃度為200、500、1 000、2 000、4 000、6 000 μg/L的1’-OH MDZ溶液，按1.5.1方法處理，制備平行雙管，用外標(biāo)法定量，以1’-OH MDZ的色譜峰面積為縱坐標(biāo)，對應(yīng)的濃度為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.5.4 回收率、精密度及穩(wěn)定性 于空白孵育體系(不加NADPH)中加入1’-OH MDZ標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別配成終濃度為300、1 500、5 000 μg/L的低、中、高濃度的孵育體系，按1.5.1項方法處理后上樣。平行測定5次，計算回收率。1 d內(nèi)和連續(xù)3 d內(nèi)測定5次，計算日內(nèi)和日間變異。分別在當(dāng)天及室溫下放置24 h后測定1’-OH MDZ濃度，考察色譜峰的相對保留時間和峰面積的一致性。

1.6標(biāo)本中CYP3A4酶活性檢測取6支EP 管，按1.4條件下配制孵育體系，加入適量的MDZ標(biāo)準(zhǔn)品，使每個反應(yīng)體系中MDZ 終濃度分別為4、6、8、12、18、24 μmol/L，37 ℃條件下孵育20 min， 反應(yīng)結(jié)束后按照1.5.1項下方法處理后進(jìn)樣，記錄色譜圖。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算6個體系中1’-OH MDZ 生成量, 并計算體系內(nèi)1’-OH MDZ的質(zhì)量濃度[S]，求出每個反應(yīng)體系的速率V, 根據(jù)Eadie-Hofstee方程式[7], 以V/[S]為橫坐標(biāo),V為縱坐標(biāo)擬合回歸曲線?；貧w曲線的斜率即為Km值。

1.7統(tǒng)計學(xué)處理應(yīng)用SPSS 17.0分析，不同性別患者Km值的比較采用兩獨立樣本t檢驗，患者年齡與Km值的相關(guān)性采用Pearson相關(guān)分析，不同肝膽疾病患者Km值的比較采用單因素方差分析及SNK-q檢驗，檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1HPLC方法學(xué)結(jié)果

2.1.1 專屬性 在該色譜條件下，1’-OH MDZ和MDZ的保留時間分別約為10.05和15.02 min，分離度好，且峰型對稱，孵育體系的內(nèi)源性雜質(zhì)不干擾酶活性的測定。見圖1。

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線 標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y= 0.002 8X+0.009 5，r= 0.995 2，1’-OH MDZ在200～6 000 μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.3 回收率 低、中、高3個濃度組的回收率結(jié)果測定見表 1，RSD<5%，符合測定要求。

圖1 孵育體系中的1’-OH MDZ和MDZ的色譜圖

表1 1’-OH MDZ 的回收率(n=5)

2.1.4 精密度 低、中、高3個濃度組的精密度測定結(jié)果見表 2，RSD<5%，符合測定要求。

表2 1’-OH MDZ 的精密度(n=5)

2.1.5 穩(wěn)定性 低、中、高3個劑量組的穩(wěn)定性測定結(jié)果見表 3，RSD<5%，符合測定要求。

表3 1’-OH MDZ 的穩(wěn)定性(n=5)

2.2不同性別、年齡和肝膽病變患者Km的比較

50例患者Km值為1.75～30.17 μmol/L。男性Km值為(6.990±1.241) μmol/L，女性為(7.762±1.312) μmol/L，2者比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=0.422，P=0.671)。患者年齡與Km值無相關(guān)關(guān)系(r=0.188,P=0.051)。不同肝膽病變患者Km的差異亦無統(tǒng)計學(xué)意義(表4)。

表4 不同肝膽病變患者的Km值 μmol·L-1

F=1.046,P=0.259。

3 討論

通過體外孵育測定MDZ在肝微粒體中的代謝產(chǎn)物,以代謝產(chǎn)物的生成速率為標(biāo)準(zhǔn)對CYP3A酶活性進(jìn)行評價的方法已被國內(nèi)外所認(rèn)同[8]。研究[9]也已經(jīng)證實1’-OH MDZ是CYP3A4 的特異性代謝產(chǎn)物，1’-OH MDZ測定含量能特異性地反映CYP3A4酶活性的強弱。 作者采用體外孵育的方法，以MDZ為底物對肝組織中CYP3A的酶活性進(jìn)行了測定。研究結(jié)果顯示，MDZ與1’-OH MDZ的出峰時間、分離度均較好，且峰形均勻沒有雜峰，因此所構(gòu)建的HPLC方法可以滿足肝組織中CYP3A4酶活性的測定。

國外研究顯示[3-4]：不同個體間CYP3A4 酶活性差異很大。Zhu 等[10]認(rèn)為在中國漢族人中CYP3A4酶活性呈單態(tài)分布，個體間約有14倍的差異。該研究測得50例標(biāo)本的Km值為1.75～30.17 μmol/L ，個體差異較大。結(jié)合臨床資料的研究結(jié)果表明，不同性別、年齡和肝膽病變患者Km值差異無統(tǒng)計學(xué)意義。但研究[11]認(rèn)為CYP3A4酶活性女性高于男性， Zhu等[10]的研究結(jié)果亦顯示CYP3A在代謝MDZ活性上女性高于男性。該研究結(jié)果可能是因為樣本量較少的緣故。

綜上所述，作者成功建立了測定肝組織中CYP3A4酶活性的HPLC方法，該方法可快速準(zhǔn)確測定肝組織中CYP3A4酶活性。

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