趙富周

南陽醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校第一附屬醫(yī)院胸外科 南陽 473000

食管癌是消化道常見惡性腫瘤之一。大多數(shù)患者就診時已有區(qū)域及(或)遠(yuǎn)處淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，而淋巴轉(zhuǎn)移為食管癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的主要途徑之一，可明顯影響患者的預(yù)后和生存[1-2]。淋巴轉(zhuǎn)移的機制已經(jīng)成為近年來腫瘤領(lǐng)域研究的熱點問題[3]。趨化因子受體-7(chemokine receptor-7，CCR7)在某些腫瘤組織中有較高的表達(dá)[4]，其與相應(yīng)的配體結(jié)合能夠使腫瘤血管、淋巴管形成，使表達(dá)CCR7的腫瘤細(xì)胞發(fā)生增殖、肌動蛋白凝集和偽足形成，并使腫瘤細(xì)胞沿配體濃度梯度定向轉(zhuǎn)移。腎小球上皮整合膜蛋白(Podoplanin)是一種位于腎小球足突細(xì)胞膜表面的蛋白。Podoplanin標(biāo)記淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的特異性和敏感性均較高，是當(dāng)前比較理想的一種淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物[5]。該研究通過免疫組化的方法研究40例食管癌組織中CCR7、Podoplanin的表達(dá)，旨在探討食管癌淋巴轉(zhuǎn)移的可能機制。

1 材料與方法

1.1材料40例食管癌組織標(biāo)本來自南陽醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校第一附屬醫(yī)院2011年2月至2012年2月手術(shù)切除組織，均經(jīng)兩位高年資病理醫(yī)師證實為鱗狀細(xì)胞癌(食管鱗癌)。其中男25例，女15例。年齡44～79歲，中位年齡60.1歲。按照1976年全國食管癌臨床病理分期標(biāo)準(zhǔn)：Ⅰ、Ⅱ期12例，Ⅲ、Ⅳ期28例；高、中分化21例；低、未分化19例。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移28例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移12例。每例標(biāo)本均同時取癌組織、癌旁正常食管組織，其中癌旁正常組織要求距腫瘤邊緣5 cm以上，并經(jīng)病理證實無腫瘤累及、無跳躍轉(zhuǎn)移病灶。所有病例術(shù)前均未行化放療或其他針對腫瘤的治療。

1.2CCR7和Podoplanin蛋白表達(dá)的檢測采用免疫組化SP法。鼠抗人CCR7單克隆抗體(按1300稀釋)和鼠抗人Podoplanin單克隆抗體(按1200稀釋)均購自武漢博士德生物工程有限公司，SP免疫組化試劑盒和DAB試劑盒購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。切片常規(guī)脫蠟，微波抗原修復(fù)，操作按試劑盒說明進行。用已知的食管癌陽性切片作陽性對照，以PBS代替一抗作陰性對照。

1.3結(jié)果判定①CCR7結(jié)果判定：以細(xì)胞膜和(或)細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)黃色/棕黃色顆粒為陽性細(xì)胞。先按整張切片中陽性細(xì)胞百分比評分,陽性細(xì)胞百分比為0%、1%～、25%～、50%～、75%～100%分別計為0、1、2、3、4分。再按整張切片中細(xì)胞染色深度評分：無色、淺黃色、棕褐色分別計為0、1、2分。2項評分相乘，積分<4分判為陰性，≥4分判為陽性[6]。②依據(jù)Ohno等[7]和Weidner[8]的方法，判定Podoplanin標(biāo)記淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞計數(shù)的微淋巴管密度(MLVD)值：先在低倍鏡視野下選取腫瘤中心脈管最豐富的區(qū)域，再在200倍視野下計數(shù)Podoplanin陽性脈管數(shù)，每例計數(shù)5個視野，并求其均值作為MLVD。兩名醫(yī)師計數(shù)差10%以上者重新計數(shù)。為較準(zhǔn)確判定淋巴管，對內(nèi)皮細(xì)胞著色者判定為微淋巴管，基膜與內(nèi)皮細(xì)胞均著色者則判定為微血管，對于光鏡下較難區(qū)分的管道也暫判為微血管。

1.4統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 10.0進行分析，應(yīng)用配對χ2檢驗比較2種組織中CCR7蛋白的表達(dá)；配對資料的秩和檢驗分析2種組織中Podoplanin蛋白的表達(dá)；應(yīng)用t檢驗比較食管鱗癌組織中CCR7蛋白表達(dá)陽性組與陰性組間Podoplanin蛋白的表達(dá)；分別用校正χ2檢驗和t檢驗分析食管鱗癌組織中CCR7蛋白、MLVD值與臨床病理特征的關(guān)系，檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1食管鱗癌和癌旁正常食管組織中CCR7蛋白的表達(dá)及分布特點見圖1和表1。食管鱗癌組織中CCR7蛋白陽性表達(dá)率為72.5%(29/40)。腫瘤組織浸潤邊緣和壞死明顯的區(qū)域內(nèi)呈強陽性著色；腫瘤中心部位陽性表達(dá)也較強，但與腫瘤邊緣相比相對較弱；而在癌旁正常組織中CCR7蛋白陽性表達(dá)率僅為5.0%(2/40)。

圖1 食管鱗癌(A)和癌旁正常食管(B)組織中CCR7蛋白的表達(dá)(SP，×100)

表1 食管鱗癌和癌旁正常食管組織中CCR7蛋白的表達(dá) 例

校正χ2=23.310,P<0.001。

2.2食管鱗癌和癌旁正常食管組織中Podoplanin蛋白的表達(dá)及分布特點見圖2。食管鱗癌組織中Podoplanin蛋白的分布具有異質(zhì)性，主要在癌巢周圍分布；癌旁正常食管組織黏膜下僅見少量表達(dá)。食管鱗癌組織中Podoplanin標(biāo)記的MLVD值為(7.2±3.2)，高于癌旁正常食管組織(1.5±0.5)，Z=5.416，P<0.001。

2.3食管鱗癌組織中CCR7蛋白表達(dá)與Podoplanin標(biāo)記的MLVD值的關(guān)系CCR7蛋白表達(dá)陽性的食管鱗癌組織中Podoplanin標(biāo)記的MLVD值為(8.4±5.0)，CCR7蛋白表達(dá)陰性組織中MLVD值為(2.9±2.1)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=3.478，P<0.001)。

圖2 食管鱗癌(A)和癌旁正常食管(B)組織中Podoplanin蛋白的表達(dá)(SP，×200)

2.4食管鱗癌組織中CCR7蛋白表達(dá)、MLVD值與臨床病理特征的關(guān)系見表2。

表2 食管鱗癌組織中CCR7蛋白表達(dá)、MLVD值與臨床病理特征的關(guān)系

*：校正χ2檢驗。

3 討論

近些年來，趨化因子及其受體的研究成為腫瘤淋巴轉(zhuǎn)移方面的熱點。CCR7是趨化因子CC類的受體成員之一，其配體有CCL21、CCL19，主要在淋巴結(jié)、非淋巴組織的內(nèi)皮淋巴導(dǎo)管、T細(xì)胞區(qū)表達(dá)。趨化因子CCL19/CCL21與受體CCR7相互作用，可吸引并促進CCR7蛋白陽性表達(dá)的腫瘤細(xì)胞發(fā)生偽足形成和肌動蛋白凝集，并使其沿其配體CCL19/CCL21濃度梯度定向遷移，這可能是腫瘤細(xì)胞發(fā)生淋巴轉(zhuǎn)移的機制之一[9]。研究[10]表明CCR7在許多惡性腫瘤組織中有較高表達(dá)，并對這些腫瘤細(xì)胞的趨化和淋巴結(jié)歸巢起重要作用。

Tsutsui等[11]的研究表明，腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與淋巴管生成密切相關(guān)，新生淋巴管達(dá)到一定數(shù)量后即為腫瘤的淋巴轉(zhuǎn)移創(chuàng)造了條件。因此，有針對性地標(biāo)記新生淋巴管，了解腫瘤組織淋巴管分布情況，成為研究腫瘤淋巴轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵。Breteneder-Geleff等[12]首次提出利用Podoplanin染色法判定淋巴管，為腫瘤淋巴管生成研究提供了較為可靠的手段。

該研究采用免疫組化法檢測了食管鱗癌組織、癌旁正常食管組織中CCR7蛋白的表達(dá)，并計數(shù)了以Podoplanin標(biāo)記淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的MLVD值，同時分析了它們與臨床病理特征的關(guān)系。結(jié)果表明：食管鱗癌組織中CCR7的表達(dá)及MLVD值較癌旁正常食管組織明顯增高，且食管鱗癌組織中CCR7蛋白的表達(dá)及MLVD值與腫瘤病理分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移關(guān)系密切，而與性別、年齡、腫瘤直徑及分化程度無關(guān)。提示CCR7、Podoplanin蛋白表達(dá)水平的上調(diào)是食管鱗癌發(fā)生淋巴轉(zhuǎn)移過程中的重要事件。這與Ishida等[13]和張濰等[5]的研究一致。該研究還對食管鱗癌組織中CCR7蛋白陽性表達(dá)組和陰性表達(dá)組MLVD值進行了比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)陽性表達(dá)組MLVD值明顯高于陰性表達(dá)組，這在目前文獻中未見報道, 提示在腫瘤組織中CCR7蛋白的表達(dá)與腫瘤組織中形成的MLVD值是一致的，高密度的淋巴管形成為腫瘤的轉(zhuǎn)移提供了物質(zhì)條件，這也更進一步揭示了CCR7蛋白陽性表達(dá)的腫瘤更容易發(fā)生淋巴轉(zhuǎn)移的可能原因。CCR7、MLVD值可以作為反映食管鱗癌惡性生物學(xué)行為的指標(biāo)。

總之，CCR7、Podoplanin蛋白在食管鱗癌組織中均高表達(dá)，CCR7、Podoplanin在反映食管鱗癌的生長、侵襲及其淋巴轉(zhuǎn)移方面具有一致性。提示聯(lián)合檢測CCR7、Podoplanin有可能用于預(yù)測食管鱗癌淋巴轉(zhuǎn)移，這對食管鱗癌治療方案的選擇和確定有積極的指導(dǎo)意義。

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