田 芳,江亞南，張曉艷，范天黎

1)鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室 鄭州 450001 2)鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室 鄭州 450001

食管癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一，其病死率居整個(gè)惡性腫瘤的第6位[1]。食管鱗狀細(xì)胞癌(食管鱗癌)是一種侵襲性很強(qiáng)的腫瘤，預(yù)后差，臨床進(jìn)展迅速，多伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，且易復(fù)發(fā)。核因子-κB(nuclear factor-kappa B, NF-κB)是近年來發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，是由p50和p65組成的異源二聚體。在絕大多數(shù)靜止期的細(xì)胞中，NF-κB與其阻抑物IκBα蛋白相結(jié)合，以非活性形式存在于細(xì)胞質(zhì)中。許多刺激物可以通過對IκBα的磷酸化而使其降解，使解離的NF-κB進(jìn)入到核內(nèi)并暴露核識(shí)別位點(diǎn)，從而促進(jìn)靶基因的轉(zhuǎn)錄。研究[2-4]表明，在許多人類腫瘤(如肝癌、腸癌、食管鱗癌)中，NF-κB信號(hào)通路的激活在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用。辣椒素是紅辣椒中的一種活性成分，具有抗病毒、 抗腫瘤和鎮(zhèn)痛消炎作用，還可作為健胃劑，有促進(jìn)食欲、改善消化等生物學(xué)功能。最近有研究[5]表明，辣椒素可以抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、促進(jìn)凋亡，因此可以作為一種藥物或傳統(tǒng)化療藥物的輔助用藥，用于腫瘤治療。作者應(yīng)用Western blot及凝膠滯留實(shí)驗(yàn)檢測辣椒素對食管鱗癌EC9706和Eca109細(xì)胞NF-κB信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)和細(xì)胞凋亡的影響，探討辣椒素是否能夠通過阻斷NF-κB信號(hào)通路，對食管鱗癌細(xì)胞的凋亡產(chǎn)生影響。

1 材料與方法

1.1主要試劑和細(xì)胞主要試劑：抗人p65、磷酸化IκBα(pIκBα)、Bcl-2單克隆抗體和兔抗人p50、IκBα多克隆抗體均購自美國Santa Cruz 公司，細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)蛋白提取試劑盒、生物素3’末端標(biāo)記試劑盒、化學(xué)發(fā)光EMSA試劑盒購自Pierce公司，Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒購自美國Eckman coulterTM公司。RPMI 1640 培養(yǎng)液購自美國Gibco公司，辣椒素購自美國Sigma公司，氟尿嘧啶(5-FU)購自上海旭東海普藥業(yè)公司。EC9706細(xì)胞由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所分子腫瘤學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)，Eca109細(xì)胞由鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室保存，細(xì)胞在RPMI 1640培養(yǎng)液(含體積分?jǐn)?shù)10%的胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 mg/L鏈霉素)中，于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5% CO2的條件下培養(yǎng)，取對數(shù)生長期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2辣椒素的配制將辣椒素溶解在乙醇中，配成300 μmol/L的溶液，置于-20 ℃冰箱保存。臨用時(shí)，以完全培養(yǎng)液稀釋辣椒素到所需濃度。對照組培養(yǎng)液為含體積分?jǐn)?shù)10%小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液。

1.3Westernblot法檢測p65、p50、IκBα、pIκBα和Bcl-2蛋白的表達(dá)分別提取2種細(xì)胞的胞質(zhì)和胞核蛋白各50 μg，Western blot法檢測p65、p50、IκBα和pIκBα蛋白的表達(dá)。將2種細(xì)胞分別用0、50、100、200 μmol/L辣椒素作用24 h后，收集細(xì)胞，測定pIκBα蛋白的表達(dá)；同時(shí)提取總蛋白來檢測Bcl-2蛋白的表達(dá)。使用120 g/L的SDS-PAGE膠，將分離蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜上，于50 g/L脫脂奶粉溶液中作用2 h后，加入一抗(按照1100稀釋)，4 ℃孵育過夜，TBST溶液洗滌3次，10 min/次，將膜放到標(biāo)記有辣根過氧化物酶的二抗(按照150 000稀釋)中，室溫下孵育1 h，TBST洗滌3次，10 min/次，DAB顯色。

1.4NF-κB與DNA結(jié)合活性的檢測采用凝膠滯留實(shí)驗(yàn)。將細(xì)胞分別用0、100、200 μmol/L辣椒素作用24 h后，收集細(xì)胞，提取細(xì)胞核蛋白。生物素標(biāo)記的NF-κB探針序列：上游5’-AGTTGAGGG GACTTTCCCAGGC-3’,下游3’-TCAACTCCCCTGAA AGGGTCCG-5’。將探針與10 μg細(xì)胞核提取物在20 μL的緩沖液中充分結(jié)合，在60 g/L的非變性聚丙烯酰胺凝膠中電泳后，將其轉(zhuǎn)移到帶正電荷的尼龍膜上，紫外燈下交聯(lián)5 min，使用化學(xué)發(fā)光的方法，通過X線曝光，進(jìn)行顯影和定影。

1.5細(xì)胞凋亡的檢測將2種食管鱗癌細(xì)胞分別分為對照組、辣椒素組(加入辣椒素作用48 h)、5-FU組(加入5-FU作用48 h)和聯(lián)合組(同時(shí)加入辣椒素和5-FU作用48 h)，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。收集4組細(xì)胞，制備單細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)2×106個(gè)細(xì)胞，轉(zhuǎn)移進(jìn)離心管離心，棄上清，使用預(yù)冷的PBS洗2次。加2.5 μL PI和5 μL Annexin V-FITC到100 μL的細(xì)胞懸液中，混勻后，使用對照細(xì)胞調(diào)零，分別以PI和Annexin V-FITC單染管作為基準(zhǔn)參照，流式細(xì)胞儀檢測，使用CellQuest 3.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)算凋亡細(xì)胞百分比。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 13.0進(jìn)行分析， 采用2×2析因設(shè)計(jì)的方差分析比較4組凋亡細(xì)胞百分比的差異，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1EC9706和Eca109細(xì)胞中NF-κB信號(hào)通路的激活情況

2.1.1 蛋白檢測結(jié)果 EC9706和Eca109的細(xì)胞質(zhì)中IκBα蛋白為強(qiáng)表達(dá)，而pIκBα蛋白的表達(dá)稍弱(圖1)。2種細(xì)胞的胞核中均存在p50和p65蛋白(圖2)。

2.1.2 凝膠滯留實(shí)驗(yàn)結(jié)果 在2種食管鱗癌細(xì)胞的胞核中，NF-κB與 DNA的結(jié)合活性較高(圖3)。

圖1 2種細(xì)胞胞質(zhì)中IκBα和pIκBα蛋白的表達(dá)

圖2 2種細(xì)胞胞核中p50和p65蛋白的表達(dá)

圖3 NF-κB與DNA的結(jié)合活性

2.2辣椒素對2種食管鱗癌細(xì)胞pIκBα和Bcl-2蛋白表達(dá)的影響2種細(xì)胞中pIκBα和Bcl-2蛋白的表達(dá)均隨著辣椒素作用濃度的增加逐漸下降(圖4)；NF-κB與DNA的結(jié)合活性隨著辣椒素作用濃度的增加逐漸下降(圖5)。

圖4 辣椒素對EC9706(上)和Eca109(下)細(xì)胞pIκBα和Bcl-2蛋白表達(dá)的影響

圖5 辣椒素對EC9706(左)和Eca109(右)細(xì)胞NF-κB與DNA結(jié)合活性的影響

2.3辣椒素對食管鱗癌細(xì)胞凋亡的影響見表1、2。

表1 辣椒素對EC9706細(xì)胞凋亡的影響(n=3)

F辣椒素=2 535.497，F(xiàn)5-FU=4 141.322，F(xiàn)交互=113.034，P均<0.001。

表2 辣椒素對Eca109細(xì)胞凋亡的影響(n=3)

F辣椒素=5 984.040，F(xiàn)5-FU=8 316.346，F(xiàn)交互=5.150，P均<0.05。

3 討論

研究[5]認(rèn)為食物中的化學(xué)成分可以特異性影響信號(hào)通路中的特定分子，從而預(yù)防癌癥的發(fā)生。腫瘤化學(xué)預(yù)防是指利用天然的或合成的化學(xué)物質(zhì)來阻止、減緩或者逆轉(zhuǎn)癌癥發(fā)生發(fā)展過程或者復(fù)發(fā)的策略。研究[6-7]發(fā)現(xiàn)辣椒素可以通過不同的機(jī)制發(fā)揮抗炎抗腫瘤作用。

該實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在食管鱗癌細(xì)胞核中存在有NF-κB異源二聚體p50和p65的表達(dá)，且進(jìn)入到核內(nèi)的亞單位p50和p65能夠與DNA結(jié)合并促進(jìn)轉(zhuǎn)錄。NF-κB的半衰期較短，因此維持其活性就需要持續(xù)的外界刺激及蛋白合成。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，IκBα及pIκBα蛋白在食管鱗癌細(xì)胞中有表達(dá)，pIκBα的表達(dá)盡管比較弱，但足以引起IκBα的降解，刺激NF-κB的活化。上述結(jié)果顯示，在維持活化的NF-κB信號(hào)通路中IκBα在轉(zhuǎn)錄水平上的高表達(dá)及其磷酸化，起著重要的作用。

該實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著辣椒素濃度的增加，食管鱗癌細(xì)胞中pIκBα蛋白的表達(dá)逐漸下降，NF-κB與DNA的結(jié)合活性也逐漸下降。pIκBα表達(dá)水平的降低，會(huì)使NF-κB與IκBα蛋白相結(jié)合，以非活性形式存在于細(xì)胞質(zhì)中，從而抑制NF-κB信號(hào)通路的活化；辣椒素通過抑制食管鱗癌細(xì)胞中IκBα的磷酸化，使p50和p65組成的異源二聚體不能從NF-κB-IκBα上解離，從而抑制了NF-κB與DNA的結(jié)合活性。

Maity等[8]的研究表明，辣椒素可以通過抑制蛋白酶的功能，激活凋亡信號(hào)通路，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。該研究表明，在辣椒素作用下，食管鱗癌細(xì)胞中抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)下降；流式細(xì)胞儀檢測的結(jié)果顯示，食管鱗癌細(xì)胞凋亡增加；當(dāng)辣椒素與5-FU合用時(shí)，可顯著增加食管鱗癌細(xì)胞對化療藥物5-FU的敏感性，凋亡的細(xì)胞也增加。該研究結(jié)果提示，辣椒素促進(jìn)食管鱗癌細(xì)胞對5-FU敏感性的機(jī)制，或許是通過阻斷NF-κB信號(hào)通路的活性，下調(diào)其調(diào)控的下游靶基因，從而對食管鱗癌細(xì)胞的增殖、抗凋亡產(chǎn)生影響。

綜上所述，辣椒素可能通過下調(diào)NF-κB信號(hào)通路的活性，促進(jìn)食管鱗癌細(xì)胞凋亡，增加對5-FU的敏感性。辣椒素有望成為食管鱗癌化學(xué)預(yù)防中的輔助用藥。

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