呂巧莉， 涂國(guó)剛， 詹建鋒， 王嘉琦， 李少華

(南昌大學(xué) 醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)系，江西 南昌 330006)

有機(jī)磷化合物是一類(lèi)生命過(guò)程中極其重要的物質(zhì)，許多內(nèi)源活性物質(zhì)都含有磷酸酯結(jié)構(gòu)單元，他們參與了能量轉(zhuǎn)化、物質(zhì)代謝、遺傳表達(dá)等幾乎所有的生命過(guò)程[1]。在過(guò)去的研究中，有機(jī)磷藥物作為抗腫瘤藥有重大發(fā)現(xiàn)并應(yīng)用于臨床，如廣譜抗腫瘤藥環(huán)磷酰胺、異環(huán)磷酰胺、甘磷酰氮芥、阿替哌、碘替哌、噻替哌、氯磷酰胺，膦西洛普利及雙二甲磷酰胺乙酯等等。文獻(xiàn)[2～4]報(bào)道，穿心蓮內(nèi)酯衍生物大多具有良好的生物活性。因其具有內(nèi)酯環(huán)及1，3-二醇的結(jié)構(gòu)，其衍生物具有抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)及抗HIV活性[5～7]。

本文以穿心蓮內(nèi)酯(2)為先導(dǎo)化合物，對(duì)其3-位和19-位進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，設(shè)計(jì)并合成了3個(gè)新型的脫水穿心蓮內(nèi)酯環(huán)磷酸酯類(lèi)衍生物(1a～1c， Scheme 1)，其結(jié)構(gòu)經(jīng)1HNMR， IR和MS表征。初步的體外抗腫瘤活性測(cè)試結(jié)果表明，1a～1c對(duì)舌癌Tca-8113細(xì)胞具有較好的體外抑制活性。

本文通過(guò)在2的3-位和19-位引入環(huán)磷酸酯與環(huán)磷酰胺結(jié)構(gòu)，有利于提高藥物的脂溶性，從而可望提高藥物的選擇性，降低其毒性。通過(guò)測(cè)定1a～1c的生物活性，并研究其對(duì)母體生物活性的影響，為進(jìn)一步設(shè)計(jì)合成該類(lèi)化合物提供實(shí)驗(yàn)依據(jù),以期發(fā)現(xiàn)新型、 高效低毒、有應(yīng)用前景的抗腫瘤藥物。

CopmabcR21232527-O212325-ON2122Cl2324Cl-

Scheme1

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

BRUKER ADVANCE 600 M型核磁共振儀(DMSO-d6為溶劑,TMS為內(nèi)標(biāo))；Perkin Elmer Spe 1645, 1595, FT-IR型紅外光譜儀(KBr壓片);ZQ-4000/2695型質(zhì)譜儀。

磷酰二氯氮芥(3c)參考文獻(xiàn)[8]方法合成；其余所用試劑均為分析純，上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；舌癌Tca-8113細(xì)胞，武漢大學(xué)細(xì)胞典藏中心。

1.2 合成

(1)1a和1b的合成

在反應(yīng)瓶中加入PClO316 mL(0.18 mol)，攪拌下分3次加入1-萘酚865 g(60 mmol)，加畢，加入氯化鈉1 g，緩慢加熱至回流，反應(yīng)24 h(直至無(wú)HCl氣體放出)。于160 ℃蒸出過(guò)量的三氯氧磷得淡黃色油狀液體二氯磷酸酯3a。

在反應(yīng)瓶中加入26.3 g(18 mmol)和無(wú)水吡啶30 mL,攪拌使其溶解;冰浴冷卻，攪拌下緩慢滴加3a156 g(60 mmol)的二氯甲烷(19.17 mL)溶液,滴畢，反應(yīng)1 h；于室溫反應(yīng)3 h。過(guò)濾，濾液減壓蒸干得油狀液體，用氯仿溶解，依次用稀鹽酸(2×40 mL)和水(3×50 mL)洗滌，無(wú)水Na2SO4干燥，減壓蒸除溶劑得黃色固體，經(jīng)硅膠柱層析[洗脫劑：V(乙酸乙酯) ∶V(石油醚)=1 ∶2]純化得淡黃色固體脫水穿心蓮內(nèi)酯-3,19-環(huán)磷酸-1-萘酯(1a)。

用苯酚替代1-萘酚，用類(lèi)似的方法合成3b和淡黃色固體脫水穿心蓮內(nèi)酯-3,19-環(huán)磷酸苯酯(1b)。

1a： 產(chǎn)率83.7%；1H NMRδ： 0.83(s, 3H， 20-H), 1.34(m, 1H， 5-H), 1.34～1.82(m, 2H， 6-H), 1.36～1.70(m, 2H， 1-H), 1.47(s, 3H， 18-H), 2.05～2.29(m, 2H， 2-H), 2.12～2.44(m, 2H， 7-H), 2.29(m, 1H， 9-H), 3.94～4.04(m, 2H， 19-H), 4.18(m, 1H， 3-H), 4.50～4.73(brs, 2H， 17-H)， 4.89(d,J=5.4 Hz, 2H， 15-H), 6.07(d,J=13.4 Hz, 1H， 12-H), 6.64(m, 1H， 27-H)， 6.81(dd, 1H， 11-H), 7.12(br s, 1H， 26-H), 7.37(m, 1H， 22-H), 7.37(m, 1H， 23-H), 7.37(m, 1H， 25-H), 7.50(t, 1H， 14-H)， 7.62(d,J=7.8 Hz, 1H， 24-H), 8.10(d,J=7.8 Hz, 1H， 21-H)； IRν: 3 066, 2 495, 2 852, 2 360, 1 762, 1 645, 1 596, 1 573, 1 463, 1 448, 1 392, 1 290, 1 259 cm-1; MSm/z： 520.89[M+H+]。

1b： 產(chǎn)率80.9%；1H NMRδ: 0.9(d,J=6.6 Hz, 3H， 20-H)， 1.30～1.73(m, 2H， 1-H), 1.30(m, 1H， 5-H)， 1.30～1.84(m， 2H， 6-H), 1.45(s, 3H， 18-H), 2.14～2.48(m, 2H， 2-H), 2.14～2.64(m, 2H， 7-H), 2.29(m, 2H， 9-H), 3.87～4.04(m, 2H， 19-H)， 4.17(m, 1H， 3-H)， 4.58～4.80(brs, 2H， 17-H)， 4.92(dd,J=2.4 Hz, 11.4 Hz， 2H， 15-H)， 6.86(dt,J=10.2 Hz, 14.4 Hz， 1H， 12-H), 7.17(m, 1H， 22-H), 7.17(m, 1H， 26-H)， 7.22(m, 1H， 25-H), 7.33(m, 1H， 14-H), 7.33(m, 1H， 24-H)； IRν： 3 076, 2 945, 2 854, 2 341, 1 755, 1 643, 1 589, 1 489, 1 456, 1 398, 1 296, 1 188, 1 163 cm-1； MSm/z： 471.11[M+H+]。

(2)1c的合成

在反應(yīng)瓶中加入3c4 g(15 mmol)和二氯甲烷5 mL,攪拌使其溶解；冰水浴冷卻下緩慢滴加2 1.63 g(4.65 mmol)的混合液(先用吡啶4 mL熱溶，再加二氯甲烷5 mL稀釋),滴畢，反應(yīng)30 min；于室溫反應(yīng)8 h,靜置過(guò)夜。過(guò)濾，濾餅用二氯甲烷(2×10 mL)洗滌，合并濾液和洗液，減壓蒸除溶劑得油狀液體，用三氯甲烷溶解后，用水(3×40 mL)萃取，有機(jī)層用無(wú)水Na2SO4干燥，減壓蒸除溶劑得淡黃色固體脫水穿心蓮內(nèi)酯-3,19-環(huán)磷酰(二氯二乙基)胺(1c),產(chǎn)率84.7%；1H NMRδ: 0.92(d,J=6.6 Hz, 3H， 20-H), 1.27(m, 1H， 3-H), 1.30(m, 1H， 5-H)， 1.30～1.60(m, 2H， 1-H), 1.30～1.83(m, 2H， 6-H), 1.36(s, 3H， 18-H), 2.02～2.32(m, 2H， 2-H), 2.32(m, 1H， 9-H), 2.41～2.49(m, 2H， 7-H), 3.44(m, 2H， 21-H), 3.44(m, 2H， 23-H)， 3.61(m, 2H， 22-H), 3.61(m, 2H， 24-H)， 3.97(t,J=4.0 Hz 2H， 19-H)， 4.58～4.82(brs, 2H， 17-H), 4.90(dd,J=10.2 Hz, 1H， 15-H), 6.14(dd,J=4.2 Hz, 14.2Hz, 1H， 11-H), 6.86(m, 1H， 12-H), 7.48(dd,J=6.2 Hz, 7.2 Hz, 1H， 14-H)； IRν： 3 433, 2 943, 2 854, 2 503, 2 360, 1 757, 1 714, 1 627, 1 458, 1 396,1 298, 1 085, 983, 935 cm-1； MSm/z: 518.11[M+H+]。

2 結(jié)果與討論

2.1 合成

到目前為止，僅有一篇文獻(xiàn)[9]報(bào)道過(guò)脫水穿心蓮內(nèi)酯環(huán)磷酸酯的合成，其采用的合成方法是：將2，三氯氧磷，吡啶和二氯甲烷反應(yīng)，首先制成脫水穿心蓮內(nèi)酯-3,19-環(huán)磷酰氯，然再與乙醇反應(yīng)，加入少量DMAP與吡啶作為催化劑與縛酸劑，最終制得脫水穿心蓮內(nèi)酯環(huán)磷酸乙酯。由于空間位阻的影響，該方法不適用于大分子伯醇、仲醇與伯胺、仲胺等。

本文對(duì)文獻(xiàn)[9]方法進(jìn)行工藝改進(jìn)，首先將各種含羥基的化合物(包括伯醇、仲醇、酚類(lèi))及含氮(伯胺、仲胺)化合物與三氯氧磷反應(yīng)，由于三氯氧磷活性較高，可較易制得二氯磷酸酯(3)； 3再與2的3-位和19-位羥基反應(yīng)，可以較高產(chǎn)率生成脫水穿內(nèi)酯-3,19-環(huán)磷酸酯類(lèi)與環(huán)磷酰胺類(lèi)化合物。

在3的合成中，我們?cè)鴩L試了更緩和的反應(yīng)條件[10]，但是由于涉及到的試劑與操作步驟多，易引入水，使生成的產(chǎn)物又分解，降低產(chǎn)率，影響測(cè)試結(jié)果。為此采用直接將酚，NaCl和三氯氧磷進(jìn)行回流反應(yīng)制備3。

在1的合成中，除反應(yīng)過(guò)程需絕對(duì)的無(wú)水操作外，還應(yīng)注意由于反應(yīng)過(guò)程中3的活性極高，而2本身具有五元內(nèi)酯環(huán)，結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，當(dāng)遇到強(qiáng)酸或強(qiáng)堿時(shí)或反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)，均可使之開(kāi)環(huán)，大大降低產(chǎn)率，且不易分離純化，所以需要緩和的反應(yīng)條件，在此反應(yīng)過(guò)程中所有試劑均需進(jìn)行除水，溫度控制在-5 ℃～-15 ℃，反應(yīng)時(shí)間控制在冰鹽浴1 h,常溫3 h。

2.2 生物活性測(cè)試及結(jié)果

取舌癌Tca-8113細(xì)胞用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，于37 ℃， 100%濕度，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)并進(jìn)行傳代。后取于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞按5 000個(gè)/孔接種于96孔的培養(yǎng)板，加入1，使最終濃度分別為1.0×10-4mol·L-1(A), (1/2)×1.0×10-4mol·L-1(B)和(1/2)2×1.0×10-4mol·L-1(C)。每組6個(gè)平行復(fù)孔，并以單純細(xì)胞組作為空白對(duì)照，置于培養(yǎng)箱孵育24 h。待96孔板中加藥各組細(xì)胞的藥物作用24 h后，在每孔細(xì)胞中加入20 μL新鮮配制的0.5%MTT試劑，置于培養(yǎng)箱繼續(xù)避光作用4 h～5 h后，小心棄去孔內(nèi)培養(yǎng)液。于各孔中加入DMSO 150 μL，避光振蕩15 min，使結(jié)晶物溶解充分。設(shè)定570 nm波長(zhǎng)，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上測(cè)定各孔光吸收度并計(jì)算細(xì)胞抑制率，結(jié)果見(jiàn)表1。

表 1 1對(duì)舌癌細(xì)胞的抑制率*Table 1 Inhibition rate of 1 on Tca-8113

*A=1.0×10-4， B= (1/2)×1.0×10-4， C=(1/2)2×1.0×10-4

由表1可見(jiàn)，1a～1c均具有抗腫瘤活性，其中1c的抗癌效果最好。

3 結(jié)論

本文合成了3個(gè)新型的脫水穿心蓮內(nèi)酯環(huán)磷酸酯類(lèi)與環(huán)磷酰胺衍生物。該方法新穎，原料易得，成本低，過(guò)量三氯氧磷可回收利用，無(wú)三廢。

3個(gè)化合物對(duì)舌癌細(xì)胞有不同的抑制率，可為進(jìn)一步以穿心蓮內(nèi)酯為先導(dǎo)化合物開(kāi)發(fā)出更高效低毒的環(huán)磷酸酯類(lèi)與環(huán)磷酰胺類(lèi)抗腫瘤新藥奠定基礎(chǔ)。

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