王雪芳, 李錫海， 吳金美

(江蘇科技大學(xué) 生物與化學(xué)工程學(xué)院, 江蘇 鎮(zhèn)江 212018)

三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體G4(ATP binding cassette transporter G4, Abcg4)是近年來發(fā)現(xiàn)的一介導(dǎo)膽固醇流出的整合膜蛋白,為三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體超家族(ABC)成員．近來臨床發(fā)現(xiàn)Abcg4在阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease, AD)人腦中較正常人腦中高表達(dá)[1]．阿爾茨海默病即老年性癡呆,是老年人常見的神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病之一, 臨床上以進(jìn)行性智能減退和認(rèn)知功能障礙為特征．近來分子遺傳學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)的研究報(bào)道膽固醇在AD的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮一定的作用[2-4],那么對(duì)介導(dǎo)膽固醇流出的Abcg4是否參與AD的發(fā)病機(jī)制,目前尚未見報(bào)道．

RNA干涉 (RNA interference, RNAi)技術(shù)是使基因沉默的重要工具,能夠較快速地使靶基因表達(dá)下調(diào)．目前,國(guó)內(nèi)對(duì)Abcg4的相關(guān)報(bào)道甚少,采用小干擾RNA(small interfering RNA, siRNA)技術(shù)沉默活體中Abcg4基因的相關(guān)研究更尚未見報(bào)道．本試驗(yàn)中,向小鼠側(cè)腦室注射siRNA,探討有效沉默Abcg4基因的特異性序列,及其導(dǎo)入劑量和導(dǎo)入后發(fā)揮干擾作用的時(shí)間點(diǎn)．研究表明,Abcg4基因得到有效表達(dá)下調(diào),這為進(jìn)一步研究該基因的功能奠定了基礎(chǔ),也可能為以Abcg4為靶標(biāo)有效治療AD提供依據(jù)．

1 實(shí)驗(yàn)材料與設(shè)備

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與試劑

動(dòng)物:健康昆明(KM)雌性小白鼠,5周齡,17～20 g,購(gòu)自江蘇大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心．

試劑:RNAisoTMPlus、M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑、oligo(dT)、dNTP等,購(gòu)自TaKaRa有限生物公司;氯仿、異丙醇、水合氯醛、乙醇等,為上海化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn);DEPC購(gòu)自上海申能博彩生物有限公司;基因特異性引物由上海生工合成．

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

紫外分光光度計(jì)、核酸凝膠電泳儀、PCR儀,凝膠成像儀均購(gòu)自BIO-RAD;Y89-Ⅱ型電動(dòng)玻璃勻漿機(jī)購(gòu)自寧波新芝生物有限公司;DK-8D數(shù)顯恒溫水浴鍋購(gòu)自金壇市醫(yī)療儀器廠．

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 Abcg4基因在小鼠中的組織表達(dá)

2.1.1 總RNA的提取和鑒定

取5只健康昆明雌性小白鼠,頸椎脫臼致死,取適量肝、腎、脾、心、腦、眼、肺、胸腺組織,快速液氮冷凍保存．參照RNAisoTMPlus的試劑說明書提取總RNA,步驟如下:取以上組織各100 mg,分別加入1 ml RNAisoTMPlus試劑充分勻漿,轉(zhuǎn)至1.5 ml離心管中,室溫靜置5 min;加入200 μl氯仿,劇烈震蕩15 s后室溫靜置5 min,分層;4℃,12 000 g離心15 min;取上層水相于一新的離心管中,加入400 μl異丙醇,混勻后靜置10 min;4℃,12 000 g離心10 min;棄上清,沉淀用1 ml的75%乙醇洗滌后室溫干燥,適量0.1%DEPC處理水溶解．用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的提取質(zhì)量,并用紫外分光光度計(jì)測(cè)定總RNA濃度和純度．

2.1.2 半定量RT-PCR檢測(cè)

M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA．具體過程如下:取每個(gè)樣品總RNA 1 μg,oligo(dT) 2.5 pmol,dNTP (10 mmol/L each) 1 μl,加DEPC處理水至10 μl,水浴鍋上70 ℃反應(yīng)10 min,迅速置于冰上冷卻,加入5×反應(yīng)緩沖液5μl,RNA酶抑制劑25U,M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶200 U,用0.1%DEPC處理水補(bǔ)至總體積為20 μl (以上操作均在冰上進(jìn)行),稍離心后置于水浴鍋上反應(yīng),42℃,60 min;70℃,15 min,迅速置于冰上,最后將所得cDNA產(chǎn)物置于-20℃保存．

每個(gè)樣品都以反轉(zhuǎn)錄所得cDNA體積的1/10為模板,用小鼠Abcg4基因特異引物擴(kuò)增(擴(kuò)增基因部分片段,504bp),引物序列如下:Abcg4-F,5′-CCCCACGCTGTTCAGGGCTG-3′;Abcg4-R,5′-TGCTGCAGTACACCACTGGGC-3′．同時(shí)以小鼠GAPDH基因作為內(nèi)參照,其引物序列如下:GAPDH-F,5′-AAATGGGGTGAGGCCGGTGC-3′;GAPDH-R,5′-TCTCCAGGCGGCACGTCAGA-3′．以上PCR擴(kuò)增條件為94 ℃4 min,以94 ℃30 s,58℃30 s,72℃1 min,進(jìn)行25次循環(huán),72℃10 min．?dāng)U增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳并拍照．

2.2 Abcg4基因在小鼠腦中的沉默

2.2.1 合成以小鼠Abcg4基因?yàn)榘悬c(diǎn)的siRNA(Abcg4-siRNA)

參照NCBI上登錄的C57BL小鼠Abcg4基因序列(NM-138955.3),設(shè)計(jì)引物,RT-PCR克隆出Abcg4基因并測(cè)序,根據(jù)測(cè)序結(jié)果,由廣州銳博生物公司合成3個(gè)siRNA,編號(hào)為siRNA-001，siRNA-002，siRNA-003,其針對(duì)靶序列分別為: CCAGCAAAGTCTTCAACAA(1464-1482bp);CCACATTCATGAACATCTT(540-558bp); GTGAGAAGCAAGAGGTGAA(726-744bp)．合成后的siRNA保存在-20℃,使用前用去無RNAase水配成2μg/μl濃度．

2.2.2 動(dòng)物處理

試驗(yàn)中以小鼠腦為對(duì)象研究siRNA對(duì)Abcg4基因的沉默效果．將KM小鼠隨機(jī)分成siRNA側(cè)腦室干預(yù)組和PBS側(cè)腦室對(duì)照組．干預(yù)組小鼠側(cè)腦室內(nèi)注射Abcg4-siRNA,用PBS稀釋;對(duì)照組小鼠側(cè)腦室注射同等體積的PBS．側(cè)腦室注射方法:小鼠用10%水合氯醛(350 mg/kg)腹腔注射麻醉后,俯臥位,固定于腦立體定位儀,取右側(cè)側(cè)腦室進(jìn)行穿刺,穿刺位置:以前囟為圓點(diǎn),向后2.2 mm,向右旁開1.5 mm,深1.3 mm．牙科鉆顱骨鉆孔,用微量注射器進(jìn)行注射,注射后留針5 min(側(cè)腦室注射操作在南京醫(yī)科大學(xué)完成)．所有動(dòng)物在注射后24 h內(nèi),麻醉蘇醒,能夠自由活動(dòng)和進(jìn)食者,進(jìn)入下一步試驗(yàn)．

2.2.3 取材及處理

在注射后適當(dāng)?shù)臅r(shí)間點(diǎn),將小鼠迅速斷頭取腦,在冰浴上用鋒利的刮胡刀片沿正中矢狀線切開,分離兩側(cè)大腦半球,取右側(cè)大腦半球,稱約100 mg腦組織提取RNA,半定量RT-PCR檢測(cè)Abcg4表達(dá)的影響,方法同2.1．

3 結(jié)果與分析

3.1 Abcg4組織表達(dá)

紫外分光光度儀測(cè)抽提的總RNA的A260/280值在1.8～2.2之間;經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳分析,可見清晰的28，18，5 s三條帶,表明RNA完整性好,沒有發(fā)生降解．以小鼠的肝、腎、脾、心、腦、眼、肺、胸腺各組織分別1μg總RNA的逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板,半定量RT-PCR擴(kuò)增進(jìn)行組織表達(dá)分析．結(jié)果表明Abcg4在小鼠眼睛、腦、脾中均有表達(dá),其中眼睛和腦中表達(dá)量較高(圖1)．

圖1 RT-PCR檢測(cè)Abcg4基因在小鼠多種組織內(nèi)的表達(dá)情況Fig.1 Expression of Abcg4 in different tissues by means of RT-PCR

3.2 不同靶序列對(duì)Abcg4基因的干擾作用

為了比較不同靶序列對(duì)Abcg4基因的干擾效果,分別注射小鼠側(cè)腦室siRNA-001,002和003號(hào)各6 μg,PBS稀釋至6μl;對(duì)照組注射同等體積PBS．注射48 h后取小鼠腦,半定量RT-PCR測(cè)定不同組Abcg4的表達(dá)量(圖2)．結(jié)果發(fā)現(xiàn),注射siRNA-001后,小鼠腦內(nèi)abcg4基因表達(dá)水平幾乎沒受到影響,與注射PBS組Abcg4表達(dá)量基本一致;注射siRNA-002,Abcg4基因的表達(dá)量受到一定程度的影響;注射siRNA-003,Abcg4基因的表達(dá)量顯著下降．實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,siRNA對(duì)小鼠Abcg4基因的沉默作用有序列選擇性,經(jīng)比較siRNA-003抑制效果較強(qiáng),在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中選擇siRNA-003做進(jìn)一步的研究．

圖2 不同靶序列對(duì)小鼠腦內(nèi)Abcg4基因的干擾作用Fig.2 Effect of different siRNAs on Abcg4 silencing in mouse brain

3.3 注射后不同時(shí)間對(duì)Abcg4基因沉默作用的影響

為比較注射siRNA后不同時(shí)間對(duì)Abcg4基因的沉默作用,分別于小鼠注射siRNA-003后24，36，48,72 h后取腦,半定量RT-PCR測(cè)定Abcg4的表達(dá)量(圖3)．發(fā)現(xiàn)注射后24，72 h后,小鼠腦Abcg4基因的表達(dá)受到一定程度的影響;36，48 h時(shí),Abcg4基因表達(dá)量顯著降低．結(jié)果表明,siRNA對(duì)小鼠腦Abcg4基因的沉默作用有著時(shí)效性,注射后48 h效果最好．

圖3 注射后不同時(shí)間對(duì)Abcg4基因沉默作用的影響Fig.3 Effect of RNA interference after injection at different time

3.4 siRNA注射劑量對(duì)Abcg4基因表達(dá)的影響

為研究siRNA注射劑量對(duì)Abcg4基因表達(dá)的影響,分別向小鼠側(cè)腦室注射1，3，6，8μg siRNA-003,于48 h后取出腦,半定量RT-PCR法測(cè)定Abcg4基因的表達(dá)量(圖4)．發(fā)現(xiàn)siRNA注射量在一定范圍內(nèi)(1～6μg),隨注射劑量增加,抑制效果逐漸增強(qiáng),但注射劑量達(dá)到一定水平后,抑制效果的增強(qiáng)趨勢(shì)趨于平緩,6～8μg之間抑制效果變化不明顯．實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,siRNA對(duì)小鼠腦Abcg4基因的沉默作用有劑量效應(yīng),6μg即可達(dá)到顯著的抑制效果．

圖4 siRNA注射劑量對(duì)小鼠腦內(nèi)Abcg4基因表達(dá)的影響Fig.4 Dose-dependent interfering effect of siRNA on Abcg4 expression

4 討論

本研究發(fā)現(xiàn)Abcg4基因在小鼠腦、眼睛和脾中表達(dá),其中腦和眼睛中表達(dá)較高．腦是Abcg4基因高表達(dá)部位之一,這可能與其介導(dǎo)膽固醇流出的功能有關(guān),因?yàn)槟X是人體內(nèi)膽固醇含量最高的器官,在腦組織中,膽固醇的作用尤為重要．神經(jīng)軸突的信號(hào)傳遞、神經(jīng)生長(zhǎng)、修復(fù)和重塑、神經(jīng)元載體的功能及突觸的發(fā)生,成熟及可塑性的維持都離不開膽固醇的參與[5]．近來，流行病學(xué)、細(xì)胞學(xué)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明,腦中膽固醇代謝異?？蓪?dǎo)致AD發(fā)生[6],2008年,發(fā)現(xiàn)Abcg4在AD病人腦中老年斑附近的微膠質(zhì)細(xì)胞中高表達(dá)[1].擔(dān)任膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)的Abcg4與AD關(guān)系如何,目前還不清楚．本研究利用siRNA介導(dǎo)的基因干涉使腦中Abcg4基因沉默,為研究Abcg4在AD發(fā)病機(jī)制中的作用提供了新的方法．近來研究報(bào)道,將siRNA直接溶解于簡(jiǎn)單溶液中(即局部注射裸siRNA)可有效地使靶向基因沉默,這種方法易于制備和使用,操作簡(jiǎn)便,但其應(yīng)用還處于探索階段,相關(guān)報(bào)道比較少．屬于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的腦,其結(jié)構(gòu)和功能較復(fù)雜;又因?yàn)閟iRNA的極性和不穩(wěn)定性,較難與靶基因結(jié)合,且易被胞內(nèi)核酸酶降解[7,8],并可能產(chǎn)生炎癥反應(yīng)[9],這些將給利用siRNA在腦中沉默Abcg4基因增加了一定的困難．為此,文中試驗(yàn)將裸siRNA直接導(dǎo)入小鼠側(cè)腦室內(nèi),做了大量的探索性工作,經(jīng)過多次重復(fù)實(shí)驗(yàn)確定借助腦定位儀準(zhǔn)確將siRNA注射到小鼠側(cè)腦室內(nèi),能夠有效抑制Abcg4基因的表達(dá),并在此基礎(chǔ)上尋求siRNA干擾作用的最佳條件．

文中的外源siRNA是針對(duì)與KM小鼠靶基因Abcg4 mRNA所測(cè)序列完全配對(duì)而設(shè)計(jì)的,這是使組織細(xì)胞內(nèi)靶基因表達(dá)得到有效抑制的首要條件．試驗(yàn)中設(shè)計(jì)了3個(gè)siRNA短鏈,用PBS稀釋,應(yīng)用腦定位儀注射一定劑量到小鼠側(cè)腦室內(nèi),初步研究結(jié)果表明,與PBS對(duì)照組相比,注射siRNA-003的小鼠腦中Abcg4基因的表達(dá)可被有效抑制,可見,siRNA對(duì)Abcg4基因的沉默作用有序列選擇性．我們比較了不同siRNA劑量對(duì)Abcg4基因沉默作用的影響,發(fā)現(xiàn)siRNA對(duì)Abcg4基因的抑制效果也有著劑量依賴性,在一定范圍內(nèi),抑制效果隨劑量增加而增強(qiáng),但劑量達(dá)到一定水平后,效果達(dá)到最強(qiáng)并趨于平穩(wěn)．另外,比較注射后不同時(shí)間的效果,選擇有效的靶序列siRNA注射小鼠側(cè)腦室,發(fā)現(xiàn)于小鼠注射36,48 h后效果較顯著,定量分析48 h效果最好,而注射24，72 h時(shí),腦內(nèi)Abcg4基因的表達(dá)量影響不大,這表明siRNA對(duì)Abcg4基因的抑制效果有著時(shí)間依賴性．較短的時(shí)間24 h內(nèi),siRNA可能還沒完全被細(xì)胞攝取或與靶基因結(jié)合,使得siRNA未能完全發(fā)揮對(duì)靶基因的抑制作用;72 h后,時(shí)間過長(zhǎng),則可能由于體內(nèi)核酸酶的存在,siRNA又被降解．

雖然RNAi生物學(xué)已經(jīng)獲得了巨大進(jìn)展,為生物醫(yī)學(xué)研究帶來了革命性的變化,多項(xiàng)siRNA在用于治療疾病的臨床實(shí)驗(yàn)中也取得了重要成果,現(xiàn)在已成長(zhǎng)為確認(rèn)藥物靶標(biāo)和研究基因功能的有力工具．但是要使siRNA分子成功有效應(yīng)用于生物體內(nèi),并成為臨床使用的常規(guī)途徑,目前還有一些關(guān)鍵性問題需要解決,如有效性,要求增強(qiáng)siRNA對(duì)核酸酶的抗性,增強(qiáng)靶細(xì)胞的攝取;安全性,減少腎臟排泄與非靶細(xì)胞攝取,除此之外,還要考慮方便制備、成份簡(jiǎn)單、質(zhì)檢容易,臨床給藥途徑和靶向細(xì)胞等要求．所以在RNAi技術(shù)在臨床疾病治療研究中取得了的突破和發(fā)展的基礎(chǔ)之上,研制出臨床廣泛應(yīng)用的siRNA制劑及方便、高效、靶向性強(qiáng)的給藥途徑仍是今后研究的重點(diǎn)．文中采用小鼠側(cè)腦室注射技術(shù),在注射后適當(dāng)?shù)臅r(shí)間點(diǎn),適量siRNA可有效干擾Abcg4基因表達(dá)．該研究首次系統(tǒng)地報(bào)道了運(yùn)用合成的裸siRNA直接體內(nèi)注射所產(chǎn)生的對(duì)靶基因Abcg4的干涉作用,為Abcg4基因功能研究奠定了基礎(chǔ),為研究阿爾茨海默病病理機(jī)制和建立阿爾茨海默病動(dòng)物模型進(jìn)行了探索,也為研究開發(fā)阿爾茨海默病的新藥物開拓了思路,對(duì)于該疾病的進(jìn)一步研究與藥物開發(fā)有著重要的意義．

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