張洪杰, 王廣樂

(江蘇科技大學 生物與化學工程學院, 江蘇 鎮(zhèn)江 212003)

板藍根為常用中藥材,多以菘藍干燥根入藥．目前全國所用的板藍根分為兩種:一種為十字花科植物菘藍的根,在我國北方地區(qū)得到廣泛使用,習稱“北板藍”．另一種為爵床科植物馬藍的根,在華南地區(qū)及西南大部分地區(qū)得到廣泛使用,習稱“南板藍”．目前這兩種商品不論在品種或質(zhì)量上,都比較穩(wěn)定[1]．板藍根具有味苦、性寒、歸心等性質(zhì)．現(xiàn)代臨床廣泛應用于預防和治療各種病毒和細菌所引起的感冒發(fā)熱、流腦、肝炎、肺炎、扁桃體炎、腮腺炎、急性眼結(jié)膜炎和皰疹皮炎等疾?。逅{根具有較強的抗病毒活性,是公認的抗病毒中藥,同時它還有抗菌消炎、免疫調(diào)節(jié)、抗內(nèi)毒素、抗癌等作用[2]．板藍根的主要有效成分有:靛玉紅、靛藍、多糖、β-谷甾醇、Y-谷甾醇和精氨酸、谷氮酸等各種氨基酸．目前,人們認為具有治療作用的活性成分主要存在于靛藍、靛玉紅和多糖中[3]．多糖的提取一般是根據(jù)其溶解度的不同,選擇不同溫度、不同液料比的稀堿液、水作溶劑．現(xiàn)在人們逐漸將超聲波提取、微波提取、離子交換色譜法和超臨界流體萃取等應用于藥用植物有效成分的提取中[4]．

文中用水作提取劑,在單因素基礎上,采用響應面法對浸提時間,溫度和液料比工藝進行全面的研究,為提高板藍根多糖的提取率,及其后期的開發(fā)應用提供參考依據(jù)．

1 實驗

1.1 材料和試劑

板藍根,購于南水橋藥店,安徽產(chǎn)．

葡萄糖、苯酚、無水乙醇、濃硫酸、乙醚等均為分析純．

1.2 實驗儀器

DK-S28電熱恒溫水浴鍋(上海精宏實驗設備有限公司)；FA2004電子天平(上海精密儀器制造廠)；101A-2電熱恒溫鼓風干燥箱(上海市實驗儀器總廠)；VIS-723分光光度計(上海第三分析儀器廠)；80-2B離心沉淀機(上海手術機械廠)．

1.3 實驗方法

1) 板藍根粉末的預處理 首先采用索氏提取法乙醚回流2～3 h去除可溶性脂類,接著用80%乙醇回流2 h后過濾除去單糖和低聚糖,備用．

2) 顯色液的配制 往50 mL濃H2SO4中緩慢加入10 mL蒸餾水,冷卻至室溫后加入0.6 g苯酚晶體,攪拌溶解,備用．

3) 板藍根多糖的測定方法 稱取一定量的已處理好的板藍根粉末,用水作提取劑,在設定溫度下提取一定時間,靜止過濾,殘渣洗滌2～3次,合并濾液,準確移取1.0 mL濾液于試管中,加25.0 mL蒸餾水稀釋,作為測定液．移取1.0 mL測定液于干凈比色管中,加入5.0 mL顯色液,震蕩混勻后放入沸水浴30～35 min,然后放入冷水浴中冷卻至室溫35 min后,以蒸餾水做空白參比液,于490 nm處測吸光度．

4) 標準曲線的繪制 準確稱取100 mg葡萄糖,蒸餾水溶解后定容于100 mL容量瓶中,配成1 mg/mL的標準液．分別移取1.0,2.0,3.0,4.0，6.0，8.0 mL標準液至100 mL容量瓶中定容．分別移取上述溶液1.0 mL于10 mL比色管中,加5 mL顯色液,震蕩混勻,置于沸水浴中,加熱30 min后冷卻至室溫．以蒸餾水做空白參比,于490 nm處測定吸光度,繪制標準曲線[5]，可得回歸方程:A=4.702 9C-0.000 3(C為葡萄糖濃度,mg/mL),R2=0.998 6．

5) 葡萄糖質(zhì)量與提取率的計算

苯酚-硫酸法[5],以葡萄糖為基準物作標準曲線，根據(jù)標準曲線計算多糖含量．

(1)

式中：m為多糖質(zhì)量(g);D(λ)為樣品溶液吸光度;V為過濾后體積(mL);w為稀釋倍數(shù).

(2)

式中：y為多糖提取率(%);m為多糖質(zhì)量(g);M為原料質(zhì)量(g).

6) 提取液波譜分析

準確稱取5.0 g已處理好的板藍根粉末,加150 mL蒸餾水,于90 ℃下水浴7 h后過濾,取1.0 mL濾液加25.0 mL蒸餾水稀釋作為待測液．移取1.0 mL待測液于10mL比色管中,加5.0 mL顯色液于沸水浴中煮30 min,取出冷卻至室溫,于450～550 nm范圍內(nèi)每隔10 nm測其吸光度,在490 nm處有最大吸收．

7) 顯色穩(wěn)定性實驗

取0.04 mg/ mL的葡萄糖溶液于10.0 mL比色管中,加5.0 mL顯色液,于沸水浴中煮30 min,取出冷卻至室溫,在490 nm下每隔5 min測一次吸光度,考察其顯色穩(wěn)定性(圖1).

圖1 顯色穩(wěn)定性實驗Fig.1 Stability after color test

由圖1可看出,樣品在冷卻后60 min內(nèi)穩(wěn)定性較好,其中20 min內(nèi)吸光度逐漸增加,35 min后趨于穩(wěn)定,因此實驗最好在樣品冷卻至室溫35 min后測定吸光度．

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 浸提時間對板藍根多糖提取率的影響

準確稱取5份5.0 g已處理好的板藍根粉末于5個錐形瓶中,液料比為30 ∶1(mL/g),浸提溫度為80 ℃,浸提時間分別設置為4，5，6，7和8 h，過濾,殘渣洗滌2～3次,合并濾液,準確移取1.0 mL濾液于試管中,加25.0 mL蒸餾水稀釋,測定相應吸光度．根據(jù)式(2)計算多糖提取率,考察浸提時間對多糖提取率的影響(圖2)．

圖2 時間對多糖提取率的影響Fig.2 Effect of time on the extraction of radix isatidis polysaccharide

由圖2可知，在一定范圍內(nèi),隨著浸提時間的延長,多糖提取率隨時間的延長而增加;4～7 h內(nèi)多糖提取率增加顯著,7～8 h內(nèi)多糖提取率增加趨勢變緩．時間過長會使多糖的結(jié)構(gòu)破壞,從而影響多糖提取率．

2.1.2 液料比對板藍根多糖提取率的影響

準確稱取5份5.0 g已處理好的板藍根粉末于5個錐形瓶中,控制浸提時間為7 h,浸提溫度為80 ℃,液料比分別設置為10 ∶1，20 ∶1，30 ∶1，40 ∶1和50 ∶1 mL/g,過濾,殘渣洗滌2～3次,合并濾液,準確移取1.0 mL濾液于試管中,加25.0 mL蒸餾水稀釋,測定相應吸光度．計算多糖提取率,考察液料比對多糖提取率的影響,結(jié)果見圖3．

圖3 液料比對板藍根多糖提取率的影響Fig.3 Effect of liquid-solid ratio on extraction of radix isatidis polysaccharide

由圖3可知:在浸提開始階段隨溶劑的增加,板藍根多糖提取率增加,當液料比為30 ∶1時多糖提取率最大．當液料比大于30 ∶1(mL.g-1)時多糖提取率變化不明顯,說明多糖已基本溶出．從節(jié)約能源角度考慮,選擇較佳液料比30 ∶1．

2.1.3 浸提溫度對板藍根多糖提取率的影響

準確稱取5份5.0 g已處理好的板藍根粉末于5個錐形瓶中,浸提溫度分別設置為60,70,80,90和100 ℃,設定液料比為30 ∶1 mL/g,浸提時間為7 h,過濾,殘渣洗滌2～3次,合并濾液,準確移取1.0 mL濾液于試管中,加25.0 mL蒸餾水稀釋,測定相應吸光度．計算多糖提取率,考察浸提溫度對多糖提取率的影響(圖4)．

圖4 溫度對板藍根多糖提取率的影響Fig.4 Effect of temperature on extraction of radix isatidis polysaccharide

由圖4可知:在60～90 ℃范圍內(nèi),隨溫度升高多糖提取率增加,這是由于溫度升高分子熱運動加快,多糖的溶出效果增強;但當溫度達到100 ℃時多糖提取率又出現(xiàn)下降趨勢,這是因溫度過高,容易引起多糖的降解,從而導致多糖提取率下降．

2.2 響應面優(yōu)化分析

2.2.1 響應面分析因素水平的選取

根據(jù)Box-Benhnken中心組合實驗設計原理[6-9],綜合2.1單因素實驗結(jié)果，選取液料比、浸提溫度、浸提時間對多糖提取率影響顯著的3個因素,在單因素實驗的基礎上采用三因素三水平的響應面分析方法．實驗因素與水平設計見表1．

表1 響應面實驗因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface(RS) test

2.2.2 響應面分析實驗設計方案

以液料比(A)、浸提溫度(B)、浸提時間(C)為自變量,以多糖提取率為響應值(Y),進行響應面分析實驗．實驗方案及結(jié)果見表2．

表2 響應面及實驗分析結(jié)果Table 2 Results of the RS test

2.2.3 響應面方差分析

利用Design-Expert軟件對表2實驗數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合,得到各因素與多糖提取率的二次多項回歸模型:Y=9.85-0.27A+1.88B+0.31C-0.72AB+0.75AC-0.54BC-1.39A2-0.83B2+0.90C2;運用響應面分析法對所建立的數(shù)學模型結(jié)果進行方差分析,回歸分析結(jié)果見表3．

表3 回歸分析結(jié)果Table 3 Statistical results of regression analysis

回歸方程中各變量對指標(響應值) 影響的顯著性是由F值來判定的,p越小,相應變量的顯著性就越高．表3中模型的F值為23.21,p值為0.000 2,表明模型是非常顯著的．失擬項不顯著(p值0.103 1),說明該模型是合理的．由p值可知,各因素對提取率影響的大小順序為:浸提溫度>浸提時間>液料比．B，AB，AC，A2，B2和C2的p值小于0.05,對多糖提取率的影響顯著．A，B，C的交互影響作用大小為AC>AB>BC．R2=0.967 6,則證明該模型可以解釋96.76%響應值的變化,說明該模型擬合程度較好,可以用來分析和預測多糖提取率．

2.2.4 響應面分析結(jié)果繪制3D圖

由圖5可知，當液料比較低,浸提溫度較高時,提取率較高,浸提溫度和液料比相互影響明顯;當液料比較大時,浸提溫度升高,多糖提取率先增大后又有所減?。?/p>

圖5 Y=f(A, B)的響應面和等高線Fig.5 Responsive surfaces and contours of Y=f(A,B)

由圖6可知，多糖提取率隨液料比的增大,先增加后減小,當浸提時間較短時多糖提取率變化顯著,但隨著浸提時間的延長,這種變化變得緩慢．液料比和浸提時間的交互作用顯著．

圖6 Y=f(A, C)的響應面和等高線Fig.6 Responsive surfaces and contours of Y=f(A,C)

由圖7可知:在浸提溫度較低時,隨浸提時間的延長,多糖提取率有增大趨勢;而當浸提溫度較高時,多糖提取率隨時間的延長,先減小后增大．

圖7 Y=f(B,C)的響應面和等高線Fig.7 Responsive surfaces and contours of Y=f(B,C)

應用Design-Expert軟件分析可知,最優(yōu)條件為:浸提溫度90 ℃、浸提時間6 h、液料比23.8 ∶1 mL/g,板藍根多糖提取率為12.56%．根據(jù)實際調(diào)整: 浸提溫度90 ℃、浸提時間6h、液料比24 ∶1 mL/g．驗證實驗得出實際提取率為11.92%,與理論值的誤差為0.64%．由此可知,響應面優(yōu)化板藍根多糖提取工藝參數(shù)準確,具有實際可操作性．

3 結(jié)論

1) 各因素對多糖提取率影響的大小順序為:浸提溫度>浸提時間>液料比．

2) 最佳提取工藝條件為:浸提溫度90 ℃、液料比24 ∶1 mL/g、浸提時間6 h,在此條件下多糖提取率最高,達到11.92%.實際提取率與理論值相差較小,說明該模型能夠很好地預測實驗結(jié)果,可以簡單快速地用來設計和分析各種與此相關的實驗．

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