陳 巖， 王淑惠， 黃寶青， 倪 雄， 黃曉春， 秦陽(yáng)華

(1.上海市長(zhǎng)海醫(yī)院實(shí)驗(yàn)診斷科，上海200433;2.上海醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)09級(jí)，上海201318;3.上海市長(zhǎng)海醫(yī)院血液內(nèi)科，上海200433)

血液病患者常因大劑量化療、骨髓干細(xì)胞移植和免疫抑制劑的使用，具有較高的發(fā)生侵襲性真菌感染(invasive fungal diseases，IFD)的風(fēng)險(xiǎn)。IFD發(fā)病快、病情重、病死率高，是血液病患者死亡的主要病因之一，并且早期診斷困難，抗真菌治療不及時(shí)是目前IFD病死率較高的主要原因。IFD確診困難，主要依賴于無(wú)菌標(biāo)本真菌培養(yǎng)陽(yáng)性(如血液培養(yǎng)出念珠菌屬真菌)或組織病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)組織內(nèi)有真菌菌絲和/或孢子，組織病理陽(yáng)性是診斷IFD的金標(biāo)準(zhǔn)，但組織標(biāo)本往往取材困難，并具有創(chuàng)傷性，標(biāo)本也需要特殊染色，耽誤了患者的診斷和治療。為了更快、更準(zhǔn)確地診斷IFD，近年一些新的指標(biāo)被引入用于診斷IFD，包括1，3-β-D-葡聚糖檢測(cè)(G試驗(yàn))和半乳甘露聚糖檢測(cè)(GM試驗(yàn))。由于G試驗(yàn)可以檢測(cè)出臨床常見(jiàn)的2種IFD［包括系統(tǒng)性念珠菌病(systemic candidas)和肺曲霉病(pulmonary aspergillosis)］而被廣泛用于臨床檢測(cè)。我們系統(tǒng)分析了G試驗(yàn)在診斷惡性血液病患者IFD中的價(jià)值。

材料和方法

一、研究對(duì)象

以2010年3月至2011年11月在長(zhǎng)海醫(yī)院血液科住院治療的血液腫瘤患者為研究對(duì)象，共計(jì)220例，男133例，女87例，年齡13～87歲，均為經(jīng)病理診斷確診的血液系統(tǒng)惡性腫瘤患者，包括73例IFD患者，其中確診4例(5.5%)、臨床診斷29 例(39.7%)、擬診40 例(54.8%)。

二、方法

血漿1，3-β-D-葡聚糖濃度檢測(cè)采用北京金山川公司MB-80微生物動(dòng)態(tài)快速檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程操作。以試劑盒推薦的診斷值(20 pg/mL)判定G試驗(yàn)陽(yáng)性。

IFD診斷依據(jù)中國(guó)IFD工作組制定的《血液病/惡性腫瘤患者侵襲性真菌感染的診斷標(biāo)準(zhǔn)與治療原則》［1］(2010年第3次修訂)并做適當(dāng)調(diào)整，即G試驗(yàn)結(jié)果單獨(dú)作為診斷指標(biāo)和不考慮G試驗(yàn)結(jié)果時(shí)根據(jù)臨床表現(xiàn)、微生物檢驗(yàn)、影像和病理結(jié)果診斷，分為確診、臨床診斷和擬診IFD，并以患者發(fā)熱(＞38.5℃)時(shí)間為研究起點(diǎn)確定診斷時(shí)間。

傳統(tǒng)診斷方法指不考慮G試驗(yàn)結(jié)果綜合患者易感因素、臨床特征、影像和實(shí)驗(yàn)室等其他指標(biāo)根據(jù)《血液病/惡性腫瘤患者侵襲性真菌感染的診斷標(biāo)準(zhǔn)與治療原則》(2010年第3次修訂)診斷。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用GraphPad Prism 5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，2組數(shù)據(jù)比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)，率的比較采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、血漿1，3-β-D-葡聚糖濃度單指標(biāo)診斷惡性血液病患者IFD的性能

G試驗(yàn)陽(yáng)性與傳統(tǒng)診斷標(biāo)準(zhǔn)比較結(jié)果見(jiàn)表1。在220例患者中G試驗(yàn)診斷陽(yáng)性患者97例，與傳統(tǒng)試驗(yàn)方法診斷的73例患者相比，G試驗(yàn)有較高的敏感性，但會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性，G試驗(yàn)陰性的患者可以排除IFD的可能性，G試驗(yàn)指標(biāo)診斷惡性血液病患者IFD的敏感性為98.6%［95%可信區(qū)間(CI):92.60%～99.97%］，特異性為83.0%(95%CI:75.93%～88.68%)，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為74.2%(95%CI:64.4%～82.6%)，陰性預(yù)測(cè)值為99.2%(95%CI:95.6%～99.9%)。2 種方法比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。

表1 惡性血液病患者血漿1，3-β-D-葡聚糖濃度單指標(biāo)診斷IFD和傳統(tǒng)診斷方法的比較 (例)

二、血漿1，3-β-D-葡聚糖濃度診斷惡性血液病患者IFD的受試者工作特征(ROC)曲線

血漿1，3-β-D-葡聚糖濃度在0～100 pg/mL范圍內(nèi)診斷惡性血液病患者IFD的ROC曲線見(jiàn)圖1。ROC曲線下面積為0.946 1(95%CI:0.92～0.98)。取≥10 pg/mL為診斷閾值時(shí)敏感性為100.0%(95%CI:91.4%～100.0%)，特異性為75.2%(95%CI:67.2%～82.1%);取≥20 pg/mL為診斷閾值時(shí)敏感性為97.6%(95%CI:87.1%～99.9%)，特異性為85.8%(95%CI:79.0%～91.1%);取≥50 pg/mL為診斷閾值時(shí)敏感性為36.6%(95%CI:22.1%～53.1%)，特異性為97.8%(95%CI:93.9%～99.6%)。

三、血漿1，3-β-D-葡聚糖濃度幫助早期診斷惡性血液病患者IFD

以72例惡性血液病患者發(fā)生IFD前發(fā)熱(體溫≥38.5℃)為起點(diǎn)，統(tǒng)計(jì)患者G試驗(yàn)結(jié)果陽(yáng)性時(shí)間和按照傳統(tǒng)診斷標(biāo)準(zhǔn)的診斷時(shí)間，結(jié)果見(jiàn)圖2。G試驗(yàn)陽(yáng)性時(shí)間(3.86±2.92)d，而傳統(tǒng)診斷標(biāo)準(zhǔn)的診斷時(shí)間(7.52±4.32)d。以血漿 1，3-β-D-葡聚糖作為診斷指標(biāo)可以顯著縮短IFD的診斷時(shí)間(P＜0.01)。

圖1 惡性血液病患者血漿1，3-β-D-葡聚糖診斷IFD的ROC曲線

圖2 G試驗(yàn)和傳統(tǒng)診斷標(biāo)準(zhǔn)診斷IFD所需時(shí)間

討 論

IFD是惡性血液病患者的常見(jiàn)并發(fā)癥。由于缺乏典型的臨床表現(xiàn)、實(shí)驗(yàn)室檢查陽(yáng)性率低、影像學(xué)表現(xiàn)缺乏特異性，常導(dǎo)致IFD的診斷存在較大難度，常發(fā)生誤診和漏診。目前歐美及國(guó)內(nèi)IFD的診斷標(biāo)準(zhǔn)只有2條:組織病理學(xué)證據(jù)和活組織標(biāo)本或正常情況下無(wú)菌腔液標(biāo)本培養(yǎng)陽(yáng)性［2］，而血液病患者病情較危重且常合并其他感染性疾病，累及部位不明確，侵入性檢查較難實(shí)施，難以確診。傳統(tǒng)真菌檢測(cè)方法的檢出率低，如痰培養(yǎng)曲霉菌的檢出率僅為8%～34%［3］，因而 IFD有著較高的死亡率。IFD常見(jiàn)臨床類型為系統(tǒng)性念珠菌病和肺曲霉病，其病原體分別是念珠菌屬(Candida spp)和曲霉屬(Aspergillus spp)，念珠菌屬和曲霉屬真菌有相似的細(xì)胞壁成分——1，3-β-D-葡聚糖，是廣泛存在于除接合菌及隱球菌以外的真菌細(xì)胞壁中的一種多糖，占細(xì)胞壁干重的50%以上，在酵母樣真菌中含量最高［4-5］。淺表真菌感染時(shí)1，3-β-D-葡聚糖極少能釋放入血液，而當(dāng)發(fā)生IFD時(shí)經(jīng)吞噬細(xì)胞的吞噬、消化等處理，1，3-β-D-葡聚糖可從真菌壁釋放入體液，從而使血及其他體液中的1，3-β-D-葡聚糖濃度明顯上升［6］。因此可以用血漿 1，3-β-D-葡聚糖診斷深部真菌感染，并且1，3-β-D-葡聚糖僅存在于真菌的細(xì)胞壁中，細(xì)菌和人類細(xì)胞壁不存在1，3-β-D-葡聚糖，故G試驗(yàn)陽(yáng)性對(duì)于診斷深部真菌感染具有較好的特異性。采用血清真菌細(xì)胞壁成分曲霉半乳甘露聚糖抗原和1，3-β-D-葡聚糖抗原檢測(cè)診斷IFD的特異性和敏感性可達(dá)80%以上［7］。對(duì)于G試驗(yàn)在診斷IFD的價(jià)值許多學(xué)者都進(jìn)行了研究，Pazos等［8］研究結(jié)果顯示，血漿G試驗(yàn)的敏感性、特異性、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值分別為87.5%、89.6%、70.0% 和96.3%，有超過(guò) 2/3的患者該指標(biāo)的陽(yáng)性結(jié)果明顯早于臨床癥狀和影像學(xué)異常，提示該指標(biāo)對(duì)IFD早期診斷可能有利，并發(fā)現(xiàn)血漿1，3-β-D-葡聚糖濃度可隨病情而動(dòng)態(tài)變化，對(duì)判斷病情和療效有一定意義。G試驗(yàn)敏感性和特異性的不同與實(shí)驗(yàn)設(shè)定的閾值有關(guān)［9］，而對(duì)于G試驗(yàn)在診斷IFD時(shí)的閾值仍有爭(zhēng)議。本研究采用MB-80微生物動(dòng)態(tài)快速檢測(cè)系統(tǒng)分別比較以10、20、50 pg/mL為閾值時(shí)診斷IFD的敏感性、特異性。通過(guò)對(duì)結(jié)果進(jìn)行ROC曲線分析發(fā)現(xiàn)，以≥20 pg/mL為診斷閾值時(shí)曲線下面積最大，敏感性為97.6%(95%CI:87.1%～99.9%)，特異性為85.8%(95%CI:79.0%～91.1%)，而且相比于傳統(tǒng)診斷標(biāo)準(zhǔn)的診斷時(shí)間(7.52±4.32)d，G試驗(yàn)只需要(3.86±2.92)d，明顯縮短了 IFD的診斷時(shí)間，為臨床診斷和治療贏得了寶貴時(shí)間。G試驗(yàn)在診斷IFD中的價(jià)值越來(lái)越受到學(xué)者的廣泛關(guān)注，尤其在2008年修訂的深部真菌感染的診斷標(biāo)準(zhǔn)中將G試驗(yàn)納入微生物學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，使IFD的診斷率明顯提高［10］。因此 1，3-β-D-葡聚糖可作為IFD的早期無(wú)創(chuàng)檢測(cè)指標(biāo)之一。如果能較好的利用G試驗(yàn)就可以減少診斷時(shí)間，較早的對(duì)疾病進(jìn)行治療。但G試驗(yàn)檢測(cè)受到干擾因素較多，有一定的假陽(yáng)性率。在本研究中確診的IFD患者73例，而G試驗(yàn)陽(yáng)性97例，有假陽(yáng)性的結(jié)果。分析導(dǎo)致假陽(yáng)性的原因有:某些醫(yī)療物品中含有葡聚糖，某些品牌的靜脈制劑(白蛋白、凝血因子、免疫球蛋白等)中含葡聚糖，鏈球菌敗血癥患者［11］，化療或放療引起的黏膜炎癥使食物中的葡聚糖可以通過(guò)受損的胃腸道黏膜進(jìn)入到血液中，以真菌作為原料制成的抗菌藥物［12］。并且在念珠菌、曲霉菌、卡氏肺囊蟲(chóng)感染均可出現(xiàn)G試驗(yàn)陽(yáng)性，故G試驗(yàn)只能確定有無(wú)真菌感染，不能鑒定具體菌種。由于抗真菌藥物的長(zhǎng)期應(yīng)用，其他多種少見(jiàn)的真菌也在逐漸增多［13］，而關(guān)于 G試驗(yàn)假陰性的報(bào)道較少，Pickering等［14］報(bào)道G試驗(yàn)以80 pg/mL為陽(yáng)性閾值的敏感性、特異性、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值分別為93.3%、77.2%、51.9%、97.8%，指出 G 試驗(yàn)最有用的價(jià)值是其陰性預(yù)測(cè)值較高，陰性結(jié)果可以排除IFD。本研究數(shù)據(jù)亦支持此結(jié)論，G試驗(yàn)排除IFD的患者均為IFD陰性。

總之，G試驗(yàn)在診斷IFD有著較高的敏感性和特異性，可以在疾病早期進(jìn)行診斷，為臨床醫(yī)生盡早干預(yù)治療節(jié)約時(shí)間，降低患者死亡率，并且可以結(jié)合G試驗(yàn)較好的陰性預(yù)測(cè)值排除IFD，可幫助臨床合理用藥，防止抗真菌藥物的過(guò)度使用。

［1］《中華內(nèi)科雜志》編輯委員會(huì).血液病/惡性腫瘤患者侵襲性真菌感染的診斷標(biāo)準(zhǔn)與治療原則(修訂版)［J］.中華內(nèi)科雜志，2007，46(7):607-610.

［2］黃曉軍.血液病/惡性腫瘤患者侵襲性真菌感染的診斷標(biāo)準(zhǔn)與治療原則(草案)［J］.中華內(nèi)科雜志，2005，44(7):554-556.

［3］Khan ZU，Ahmad S，Theyyathel AM.Detection of Aspergillus fumigatus-specific DNA，(1-3)-beta-D-glucan and galactomannan in serum and bronchoalveolar lavage specimens of experimentally infected rats［J］.Mycoses，2008，51(2):129-135.

［4］Odabasi Z，Mattiuzzi G，Estey E，etal.Beta-D-glucan as a diagnostic adjunct for invasive fungal infections:validation，cutoff development，and performance in patients with acute myelogenous leukemia and myelodysplastic syndrome［J］. Clin Infect Dis，2004，39(2):199-205.

［5］廖萬(wàn)清.侵襲性真菌感染的實(shí)驗(yàn)室診斷［J］.檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)，2010，25(7):503-506.

［6］呂沛華，趙蓓蕾，施 毅，等.侵襲性肺部真菌感染動(dòng)物模型制作及血漿β-葡聚糖檢測(cè)的診斷價(jià)值［J］.中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2007，17(11):1328-1331.

［7］Verweij PE，F(xiàn)igueroa J，Van Burik J，etal.Clinical applications of non-culture based methods for the diagnosis and management of opportunistic and endemic mycoses［J］.Med Mycol，2000，38(Suppl 1):161-171.

［8］Pazos C，Pontón J，Del Palacio A.Contribution of(1-＞3)-beta-D-glucan chromogenic assay to diagnosis and therapeutic monitoring of invasive aspergillosis in neutropenic adult patients:a comparison with serial screening for circulating galactomannan［J］.J Clin Microbiol，2005，43(1):299-305.

［9］Persat F，Ranque S，Derouin F，etal.Contribution of the(1-＞3)-beta-D-glucan assay for diagnosis of invasive fungal infections［J］.J Clin Microbiol，2007，46(3):1009-1013.

［10］De Pauw B，Walsh TJ，Donnelly JP，etal.Revised definitions of invasive fungal disease from the European Organization for Research and Treatment of Cancer/Invasive Fungal Infections Cooperative Group and the National Institute of Allergy and Infectious Diseases Mycoses Study Group(EORTC/MSG)Consensus Group［J］.Clin Infect Dis，2008，46(12):1813-1821.

［11］Digby J，Kalbfleisch J，Glenn A，etal.Serum glucan levels are not specific for presence of fungal infections in intensive care unit patients［J］.Clin Diagn Lab Immunol，2003，10(5):882-885.

［12］高 蕾，周 新.(1，3)-β-D葡聚糖檢測(cè)在侵襲性真菌感染中的診斷意義［J］.中國(guó)感染與化療雜志，2008，8(2):123-125.

［13］Aubry A，Porcher R，Bottero J，etal.Occurrence and kinetics of false-positive Aspergillus galactomannan test results following treatment with beta-lactam antibiotics in patients with hematological disorders［J］.JClin Microbiol，2006，44(2):389-394.

［14］Pickering JW，Sant HW，Bowles CA，etal.Evaluation of a(1-＞3)-beta-D-glucan assay for diagnosis of invasive fungal infections［J］.J Clin Microbiol，2005，43(12):5957-5962.