王力剛, 朱 娟, 王 猛, 唐順明, 2, 沈興家, 2

(1.江蘇科技大學, 江蘇 鎮(zhèn)江 212018)(2.中國農(nóng)業(yè)科學院蠶業(yè)研究所 農(nóng)業(yè)部蠶桑遺傳改良重點實驗室,江蘇 鎮(zhèn)江 212018)

家蠶是一種重要的經(jīng)濟昆蟲和模式生物,家蠶滯育機理研究一直受到學界的關注并取得了重要進展[1-3].根據(jù)自然條件下1年內發(fā)生的世代數(shù)可將家蠶分為一化性(univoltinism)、二化性(bivoltinism)和多化性品種(polyvoltinism).不同化性的家蠶發(fā)生滯育的情況也不同,家蠶二化性品種的滯育性由遺傳性決定并受上代環(huán)境影響[4-6].滯育激素(DH)在決定家蠶胚胎滯育中有著重要作用[4- 5, 7],胚胎期25 ℃光照處理,至蛹期咽下神經(jīng)節(jié)(SG)合成和分泌滯育激素DH,成蟲交配后產(chǎn)滯育卵;相反,胚胎期15 ℃暗催青處理,SG合成和分泌的DH少,成蟲交配后產(chǎn)非滯育卵[8].研究表明：家蠶滯育激素受體基因Bmdhr主要在蛹中期卵巢中表達[7],DH必須與滯育激素受體(BmDHR)結合,通過調控下游基因的表達變化才能啟動滯育[6, 9].但是,目前人們對Bmdhr表達的調控機制尚不清楚.

為了深入研究家蠶滯育的分子機理,本實驗根據(jù)家蠶基因組數(shù)據(jù)庫公布的Bmdhr上游序列(Bm-scaf 84 | BABH01033472.1)設計PCR引物,以家蠶二化性品種“秋豐”基因組DNA為模板,克隆了1 395 bp(-1 364 ～+31 nt)和972 bp(-941 ～+31 nt)2個不同長度的Bmdhr啟動子序列,構建Bmdhr啟動子驅動的熒光素酶基因報告載體,利用家蠶細胞瞬時表達分析系統(tǒng)分析其轉錄活性和外源昆蟲保幼激素類似物(JHA)、蛻皮激素(20-OH-ecdysone)和滯育激素(DH)對其活性的影響.

1 實驗

1.1 實驗試劑

家蠶二化性品種“秋豐”、宿主菌E.coliTop10、質粒載體pMD18T和pGL3.0 basic 載體(含有熒光素酶基因luc)、BmN細胞株由農(nóng)業(yè)部蠶桑遺傳改良重點實驗室保存.蛻皮激素20-OH-ecdysone由中國農(nóng)業(yè)科學院蠶業(yè)研究所附屬蠶藥廠生產(chǎn)并提供；保幼激素類似物(JHA)ZR-515購自Sigma公司；滯育激素(MW:2731.01)由上海強耀生物科技有限公司合成.各種限制性內切酶、Taq酶、T4 DNA連接酶、Proteinase K等主要試劑購自TaKaRa(大連)有限公司.TC-100昆蟲細胞培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、lipofectin試劑購自Invitrogen公司.熒光素酶檢測試劑盒(E4030)購自Promega公司.核苷酸引物的合成、測序委托上海生工生物有限工程公司完成.

1.2 家蠶基因組DNA的提取

取家蠶品種秋豐5齡第3日幼蟲后部絲腺,參照文獻[10]的方法提取家蠶基因組DNA,經(jīng)濃度和純度檢測后,-20℃保存?zhèn)溆?

1.3 啟動子序列擴增

根據(jù)家蠶基因組數(shù)據(jù)庫公布的Bmdhr序列(Bm-scaf 84 | BABH01033472.1),使用Oligo 6軟件分別在-1 400 bp和-1 000 bp左右設計上游引物,在+10 bp處設計下游引物,并分別導入KpnⅠ和BglⅡ酶切位點(下劃線部分):F1 5′-GGTACCCGTCGGACTTGTCGGATCT-3′,F2 5′-GGTACCGTGTTGAAGTG CATGGACGA-3′,R 5′-AGATCTGACCAGCCCTCTCGACTACATT-3′.

以家蠶基因組DNA為模板,進行PCR擴增,擴增條件為94℃預變性5 min,94℃、45 s，60℃、1 min，72℃、2 min,25個循環(huán)后72℃延伸10 min.PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳鑒定和分離,用DNA回收試劑盒純化后克隆到pMD18-T載體中,進行測序驗證.

1.4 載體構建

將測序正確的質粒使用KpnⅠ-BglⅡ內切酶雙酶切后電泳,分離純化獲得不同長度的Bmdhr基因啟動子片段,在T4 DNA連接酶作用下克隆到經(jīng)同樣酶消化的pGL3.0 Basic載體中,轉化E.coliTop10,篩選出重組質粒pGL-Bmdhr1364-luc、pGL-Bmdhr941-luc,并進行酶切鑒定.

1.5 細胞培養(yǎng)、轉染與瞬時表達

家蠶細胞系BmN參照文獻[11]的方法進行細胞培養(yǎng)傳代.細胞用24孔板培養(yǎng)24 h,轉染前去除培養(yǎng)基并用無血清培養(yǎng)基洗滌2次,將100 μL含有5 μL脂質體和1 μg報告質粒的轉染液與1 mL無血清TC-100培養(yǎng)基混勻,溫育細胞4～5 h,除去舊培養(yǎng)基,加入300 μL含有10% FBS的TC-100培養(yǎng)基,激素處理組更換培養(yǎng)基時加入不同濃度ZR515、β-蛻皮激素和DH,對照組加等體積ddH2O,以pGL3.0 basic轉染的細胞為空白對照,每組實驗重復3次.

1.6 熒光素酶分析

細胞轉染72 h后,4℃ 5 000 r/min離心5 min收集細胞,去上清液,按照E4030試劑盒(promega)的說明裂解細胞.加100 μL熒光素酶底物于測定管中,然后加入20 μL的細胞裂解液并混勻,在LuminoMeter 20/20熒光光度計上測定熒光素酶(LUC)活性(2 s延遲，10 s讀數(shù)),以相對熒光強度單位(relative luminescence unit,RLU)表示[12].平行測定細胞總蛋白濃度,以校正報告質粒的熒光素酶活性值[13].使用SPSS軟件進行差異性分析.

2 結果與分析

2.1 不同長度Bmdhr啟動子活性比較

經(jīng)M13引物雙向測序后,分別得到長度為1 395 bp和972 bp的片段.2個啟動子片段分別包含1 364 bp和941 bp的5’上游序列,以及31 bp的第1外顯子部分序列.比對結果表明：克隆的片段與公布的Bm-scaf 84 | BABH01033472.1序列一致,說明已成功克隆到Bmdhr啟動子片段.

將構建好的報告質粒pGL-Bmdhr1364-luc、pGL-Bmdhr941-luc和pGL3.0 basic質粒分別轉染BmN細胞,轉染4～5 h后使用完全培養(yǎng)基替換舊培養(yǎng)基.72 h后收集細胞,檢測LUC活性,并經(jīng)空載體和總蛋白量矯正,結果見表1.從表中可看出，Bmdhr-941啟動子活性明顯高于Bmdhr-1364啟動子,前者是后者的2.1倍,這表明Bmdhr基因轉錄起始位點上游-941～-1 364 nt區(qū)域可能存在負調控元件.

表1 不同長度的Bmdhr啟動子活性Table 1 Activities of different length Bmdhr promoter

2.2 JHA對Bmdhr啟動子活性的影響

將構建好的報告質粒pGL-Bmdhr-1364和pGL3.0 basic質粒分別轉染BmN細胞,轉染4～5 h后使用保幼激素類似物(ZR515)濃度為0,1,2,4,6和8 μg/mL的完全培養(yǎng)基替換舊培養(yǎng)基.72 h后檢測LUC活性,并經(jīng)空載體和總蛋白量矯正,結果見圖1.當保幼激素類似物濃度為2,4,6 μg/mL時,啟動子的活性極顯著增強(F=2.382,P=0.003<0.01),分別是濃度為0時的2.0,2.1和1.5倍;而當保幼激素類似物濃度為1 μg/mL時,啟動子活性顯著減弱(F=0.867,P=0.021<0.05),濃度為8 μg/mL時,啟動子的活性則極顯著減弱(F=0.019,P=0.001<0.01).

圖1 保幼激素類似物對Bmdhr啟動子的活性影響Fig.1 Effects of JHA on Bmdhr promoter activities

2.3 20-OH-ecdysone對Bmdhr啟動子活性的影響

將構建好的報告質粒pGL-Bmdhr-1364和pGL3.0 basic質粒分別轉染BmN細胞,轉染4～5 h后使用β-蛻皮激素濃度為0,1,2,4,6,8和10 μg/mL的完全培養(yǎng)基替換舊培養(yǎng)基.72 h后檢測LUC活性,并經(jīng)空載體和總蛋白量矯正，結果見圖2.當β-蛻皮激素濃度為0時,Bmdhr基因啟動子的活性為677±24.33;當β-蛻皮激素濃度為1,2,6,8,10 μg/mL時,啟動子的活性增加極顯著(F=85.831,P=0.001<0.01),分別是濃度為0時的1.8,2.8,1.2,2.2,2.4倍;而濃度為4 μg/mL的條件下,啟動子活性明顯減弱(F=28.012,P=0.013<0.05),僅是濃度為0 μg/mL時的80%.

圖2 20-OH-ecdysone對Bmdhr啟動子的活性影響Fig.2 Effects of 20-OH-ecdysone on Bmdhr promoter activities

2.4 滯育激素對Bmdhr啟動子活性的影響

將構建好的報告質粒pGL-Bmdhr-1364和pGL3.0 basic質粒分別轉染BmN細胞,轉染4～5 h后用滯育激素濃度為0做對照,10,20,40,60,80和100 nM的完全培養(yǎng)基替換舊培養(yǎng)基.72 h后收集細胞,檢測LUC活性,并經(jīng)空載體和總蛋白量矯正,結果見圖3,當滯育激素濃度為10,20,40 nM時,啟動子的活性顯著增強(F=9.442,P=0.037<0.05),分別是濃度為0的1.7，2.3和1.5倍;而當滯育激素濃度為60，80和100 nM時,啟動子活性變化不顯著(F=0.491,P=0.522>0.05).

圖3 滯育激素對Bmdhr啟動子的活性影響Fig.3 Effects of DH on Bmdhr promoter activities

3 討論

家蠶滯育激素受體基因的表達具有時空特異性,它與家蠶滯育密切相關[6].本實驗克隆了2個不同長度的Bmdhr啟動子片段,經(jīng)對體外細胞瞬時表達分析,Bmdhr基因轉錄起始位點上游-1 364～-941 nt區(qū)間存在負調控元件.在線軟件(http://alggen.lsi.upc.es/recerca/menu-recerca.html)和DNAstar軟件分析顯示,1 364 bp的Bmdhr啟動子片段包含啟動子基本元件如TATA box、GATA box,還有多個上游調控元件,如EcREs (PuG(G/T)TCA)、En(engrailed)元件、Zeste元件、AntP元件和DPE元件,其中-1 364～-941 nt之間存在2個EcRE元件、1個En元件和1個AntP元件.En元件對果蠅某些基因在轉錄水平有抑制作用[14],由此可推測En元件對Bmdhr基因的表達也有抑制作用,但這還需進一步實驗證實.

在家蠶發(fā)育過程中,蛻皮激素單獨作用能引起幼蟲到蛹的變態(tài)[15].蛹期初期,在家蠶正常雌蛹血淋巴中蛻皮激素的濃度急驟增加[16],并且Bmdhr在此時的轉錄水平急速上升[6, 17],這說明蛻皮激素可能會增強Bmdhr啟動子的活性.但是,當20-OH-ecdysone為4 μg/mL時,Bmdhr啟動子的活性不但沒有增強反而呈下降趨勢,其原因則有待進一步地深入研究.

DH對Bmdhr啟動子活性的影響同樣具有劑量效應,其濃度在10～40 nM時,可顯著增強啟動子活性;當濃度達到60 nM時,啟動子活性變化不顯著.這種劑量效應與滯育激素對海藻糖酶基因啟動子調控作用[18]是吻合的.

本研究結果為探索Bmdhr基因的表達調控和闡明家蠶滯育的分子機理積累了實驗數(shù)據(jù).但是,家蠶體內Bmdhr基因的真實表達調控情況,還需要在個體水平加以深入研究才能揭示.

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