王勇，馬延超

（1.濰坊學院 體育學院，山東 濰坊 261061；2.洛陽師范學院 體育學院，河南 洛陽 471022）

心肌細胞代謝性重塑是心力衰竭(heart failure，HF)發(fā)生發(fā)展的重要機制。HF時心肌脂肪酸(fatty acid，F(xiàn)A)氧化減少、葡萄糖利用增加[1]，能量代謝的效率增加，這是心肌的自我保護機制。但同時糖酵解代謝增強，乳酸產(chǎn)生增多造成酸中毒與心肌損害，F(xiàn)A利用減少，脂質(zhì)在心臟沉積并造成心肌細胞凋亡與脂毒性心臟異常[2]，加之HF時線粒體生物合成減少[3]，能量生成進一步下降，即所謂的心肌能量饑渴(energy starvation)[4]，心功能繼之惡化，因此心肌代謝性重塑又加速了HF進程。

有氧運動可改善HF患者心肌代謝異常，但具體分子機制尚未明確。AMPK(磷酸腺苷活化蛋白激酶)是一種調(diào)節(jié)細胞內(nèi)能量代謝的酶類，其主要作用是通過激活下游信號轉導途徑促進能量產(chǎn)生，維持細胞的能量平衡穩(wěn)態(tài)。研究發(fā)現(xiàn)，AMPK在心臟的正常發(fā)育以及心肌代謝過程中起重要作用，同時對心肌缺血-再灌注損傷起保護作用[5]。關于運動與 AMPK關系的研究主要集中在骨骼肌組織，而在心肌表達的研究較少，Coven等[6]和Musi等[7]發(fā)現(xiàn)，一次急性運動可上調(diào)正常心肌AMPK活性或表達量，并呈現(xiàn)運動強度依賴性，提示AMPK在心肌能量代謝以及對運動適應中起重要作用。但長期運動對HF心臟AMPK表達及對能量代謝的影響未見報道。本研究以心梗后慢性HF大鼠為模型，觀察8周有氧運動對心功能、心肌糖原、FA和乳酸含量以及 AMPKα、PPARα、CPT-1、GLUT4、PGC-1α基因表達的影響，探討長期有氧運動對HF心臟代謝性重塑的影響及可能機制。

1 研究對象和方法

1.1 實驗動物

SPF級SD大鼠45只，體質(zhì)量260~320 g，雌雄各半，由北京維通利華實驗動物中心提供，分籠飼養(yǎng)，自由進食水。

1.2 心梗后HF模型的建立

大鼠隨機分為心梗組(MI組，30只)和假手術組(Sham組，15只)。心梗組采用冠狀動脈結扎術方法：麻醉后連接呼吸機，開胸暴露心臟，由左心耳下方2~3 mm處用0號絲線結扎左冠狀動脈前降支。Sham組只開胸穿線，不結扎，其他操作同MI組。MI組再隨機分為心梗對照組(MI-Sed組)和心梗運動組(MI-Ex組)，每組各15只。Sham組和MI-Sed組保持安靜狀態(tài)，MI-Ex組進行為期8周的運動訓練。

1.3 有氧運動方案

采用Bedford等建立的大鼠跑臺運動方案：即5 min熱身(坡度為0°，速度為5 m/min)后，坡度調(diào)為5°，速度為 10 m/min(相當于 45%VO2max)，第 1天訓練 15 min、第2天30 min、第3天45 min，從第4天開始均為60 min。5 d/周，共訓練8周。

1.4 血流動力學參數(shù)(心功能)測定

腹腔麻醉大鼠，心導管插管至左心室，連接壓力換能器，利用多媒體生物信號采集處理系統(tǒng)記錄左心室收縮期壓力(LVSP)、左心室舒張末期壓力(LVEDP)、左心室壓力最大上升速率(＋(dp/dt)max)和左室壓力最大下降速率(－(dp/dt)max)。

1.5 取材

大鼠斷頭處死后取心臟，用生理鹽水沖洗，濾紙沾干后迅速將組織置于液氮中并轉移至－80 ℃冰箱凍存待測。

1.6 心肌FA、糖原和乳酸測定

均采用比色法測定心肌勻漿液中糖原質(zhì)量分數(shù)、FA濃度和乳酸質(zhì)量摩爾濃度，嚴格按照試劑盒(南京建成生物工程研究所)操作說明進行。單位分別為：mg/g、mmol/L、μmmol/g。

1.7 實時熒光定量 PCR檢測心肌 PPARα和 CPT-1 mRNA水平

將心肌勻漿后，用Trizol法抽提總RNA，逆轉錄反應獲得cDNA，實時熒光定量PCR(ABI 7900HT型熒光定量PCR儀，美國)測定PPARα和CPT-1 mRNA含量，引物序列見表1，擴增條件：預變性95 ℃，1 min；94 ℃，30 s；54 ℃，30 s；72 ℃，1 min。共40個循環(huán)。以β-actin作為內(nèi)參，計算相對表達量。

表1 引物序列及產(chǎn)物長度

1.8 Western blot測定心肌總AMPKα蛋白、磷酸化AMPK α蛋白(p-AMPKα)、GLUT4和PGC-1α表達水平

裂解細胞后提取細胞總蛋白，采用BCA法進行蛋白定量。灌制10%的分離膠和5%的濃縮膠，恒壓120 V、80 mA預電泳10 min，上樣，進行SDS-PAGE電泳，轉移至PVDF膜上。5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，兔抗大鼠 AMPKα、AMPKα-Thr172磷酸化、GLUT4和 PGC-1α多克隆抗體于 4 ℃孵育過夜，TBST洗滌PVDF膜。加二抗后室溫孵育1 h，暗室中滴加發(fā)光底物混合物2 mL于PVDF膜上，曝光、顯影、定影。對目的蛋白進行光密度分析，以β-actin為內(nèi)參。目的蛋白相對含量＝目的蛋白灰度值/β-actin蛋白灰度值。

1.9 心肌組織病理學觀察

沿心臟長軸將心尖至結扎點取2 mm厚組織制作切片，40 g/L多聚甲醛固定，石蠟包埋，Masson染色，普通光鏡觀察各組心肌組織病理學變化。

1.10 統(tǒng)計學分析

所有數(shù)據(jù)使用SPSS 15.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。數(shù)據(jù)以“平均數(shù)±標準差”表示，使用單因素方差分析進行統(tǒng)計學檢驗，各組兩兩比較使用LSD檢驗。顯著性水平定為P<0.05，非常顯著水平定為P<0.01。

2 結果及分析

2.1 大鼠血流動力學參數(shù)的變化

表2結果顯示，與Sham組比較，MI-Sed組LVSP、±(dp/dt)max顯著性下降(均為P<0.01)，LVEDP則顯著性升高(P<0.01)；與MI-Sed組比較，MI-Ex組LVSP、±(dp/dt)max顯著性升高(均為P<0.01)，LVEDP則顯著性下降(P<0.01)。

表2 有氧運動對大鼠血流動力學參數(shù)的影響

表2 有氧運動對大鼠血流動力學參數(shù)的影響

與MI-Sed組比較，1)P<0.05，2)P<0.01；與Sham組比較，3)P<0.05，4)P<0.01

組別 n/只 LVSP/mmHg LVEDP/mmHg ＋(dp/dt)max/(mmHg·s-1) －(dp/dt)max/(mmHg·s-1)Sham 15 137.26±11.55 4.18±1.76 4 324.64±465.19 4 237.06±381.92 MI-Sed 15 78.39±9.754) 11.47±2.964) 2 478.28±215.274) 2 034.18±194.554)MI-Ex 15 108.35±13.202)3) 7.55±1.692)4) 3 674.82±298.352)4) 2 838.48±251.622)4)

2.2 心肌糖原、FA和乳酸含量的變化

與 Sham組比較，MI-Sed組糖原質(zhì)量分數(shù)降低(P<0.01)，F(xiàn)A濃度和乳酸質(zhì)量摩爾濃度升高(均為P<0.01)；與 MI-Sed組比較，MI-Ex組糖原質(zhì)量分數(shù)升高(P<0.05)，F(xiàn)A濃度和乳酸質(zhì)量摩爾濃度下降(均為P<0.01)(見表 3)。

表3 大鼠心肌糖原質(zhì)量分數(shù)、FA濃度和乳酸質(zhì)量摩爾濃度的變化

表3 大鼠心肌糖原質(zhì)量分數(shù)、FA濃度和乳酸質(zhì)量摩爾濃度的變化

與MI-Sed組比較，1)P<0.05，2)P<0.01；與Sham組比較，3)P<0.05，4)P<0.01

組別 n/只 w(糖原)/(mg·g-1) c(FA)/(mmol·L-1) b(乳酸)/(μmmol·g-1)Sham 15 4.17±1.30 0.62±0.08 122±27 MI-Sed 15 2.35±0.764) 1.75±0.284) 314±514)MI-Ex 15 3.78±0.621) 0.71±0.122) 233±352)4)

2.5 心臟組織病理學改變

Masson染色顯示。Sham組心肌細胞著色均勻，無明顯膠原成分。MI-Sed組心肌纖維化程度明顯，只有少量心肌細胞。MI-Ex組較 MI-Sed組心肌細胞增多，膠原纖維顯著減少(見圖1)。

圖1 各組心肌組織病理學變化

2.6 心肌PPARα和CPT-1 mRNA的變化

心肌PPARα和CPT-1 mRNA的變化規(guī)律一致，即MI-Sed組顯著低于Sham組(P<0.01)，MI-Ex組顯著高于MI-Sed組(P<0.01)(見圖2)。

圖2 心肌PPARα和CPT-1 mRNA的變化

2.7 心肌總AMPKα、p-AMPKα、GLUT4和PGC-1α蛋白的變化

心肌總 AMPKα蛋白在各組差異無顯著性(P>0.05)。p-AMPKα在 MI-Sed組高于 Sham 組(P<0.05)，MI-Ex組則分別高于MI-Sed組和Sham組(P<0.01)。GLUT4和 PGC-1α變化趨勢一致，即在MI-Sed組低于 Sham 組(P<0.01)，在 MI-Ex組高于MI-Sed 組(P<0.01)(見圖 3)。

圖3 心肌總AMPKα、p-AMPKα、GLUT4和PGC-1α蛋白的變化

3 討論

本研究探討了長期有氧運動對HF大鼠心肌能量代謝的影響發(fā)現(xiàn)，運動通過活化AMPK，上調(diào)下游靶分子(GLUT4、PPARα、CPT-1和PGC-1α)的基因表達，進而促進 FA利用、葡萄糖攝取與有氧氧化、線粒體生物合成增加、心肌有氧代謝能力提高，減少了心臟脂質(zhì)沉積與乳酸堆積，因此改善了HF后心臟代謝性重塑并提高心功能。

3.1 HF后心肌代謝性重塑及運動的良性效應

本研究成功建立心梗后HF模型，即MI-Sed組表現(xiàn)出典型的心梗后心室舒縮功能下降(LVSP、±(dp/dt)max顯著性下降，LVEDP則顯著性升高)，同時心肌糖原質(zhì)量分數(shù)減少、FA濃度堆積、乳酸升高、線粒體生物合成減少。8周有氧運動后，與MI-Sed組比較，MI-Ex組心功能改善(LVEDP顯著性降低，LVSP、±(dp/dt)max顯著性升高)，糖原質(zhì)量分數(shù)升高，F(xiàn)A濃度和乳酸質(zhì)量摩爾濃度下降。上述結果提示，心梗后HF心臟發(fā)生代謝性重塑，能量產(chǎn)生減少、酸中毒和脂毒性造成心功能進一步下降，有氧運動則延緩了這一病理過程的發(fā)生，這與臨床流行病學的研究一致[8-9]。但運動如何通過調(diào)節(jié)能量代謝進而改善心功能，至今仍不清楚。由于AMPK在心肌能量代謝中起關鍵作用且運動應激可使其活化[6-7]，因此，推測運動誘導的AMPK上調(diào)可能參與了對HF后心肌代謝性重塑的調(diào)節(jié)。

3.2 運動誘導的AMPK信號通路參與了HF大鼠心肌能量的調(diào)節(jié)

研究表明，AMPK在心臟的正常發(fā)育以及心肌代謝過程中起重要作用，同時對心肌缺血-再灌注損傷起保護作用[5，10]。運動時，AMP與ATP比值升高誘導AMPK活化[6]，因此一次急性運動可活化AMPK[7]，并呈現(xiàn)運動強度依賴性，提示AMPK在心肌能量代謝以及對運動適應中起重要作用，但長期運動訓練對病理心臟AMPK表達的影響尚無報道。在本研究中，經(jīng)過8周運動訓練，總AMPKα蛋白在各組差異無顯著性，p-AMPKα(AMPK磷酸化后才能被激活，所以只有p-AMPKα具有生物活性)在MI-Ex組顯著高于MI-Sed組和Sham組，說明長期有氧運動可持續(xù)上調(diào)AMPK表達水平，這與長期運動可提高骨骼肌、脂肪與肝臟AMPK活性的研究結果相似[11-12]，同時提示，AMPK在運動改善HF大鼠代謝性重塑中扮演重要角色。

1)運動活化AMPK-PGC-1α信號通路與線粒體生物合成。

正常心肌細胞的主要供能物質(zhì)是 FA，可產(chǎn)生60%~70%ATP，其余大約30%ATP由葡萄糖代謝供給，因此，線粒體在心肌細胞供能過程中起著至關重要的作用。PGC-1α是調(diào)節(jié)線粒體生物合成的關鍵性信號分子，其表達增加激活包括核呼吸因子(NRFs)及線粒體轉錄因子A(Tfam)在內(nèi)的一組轉錄因子，啟動線粒體DNA復制和轉錄而誘導線粒體生物合成[13]。AMPK作為PGC-1α的上游信號分子，可上調(diào)其表達[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，MI-Sed組PGC-1α蛋白水平顯著低于Sham組，提示HF時線粒體生物合成減少，這與前人的研究一致[3]。MI-Ex組p-AMPKα和PGC-1α均較MI-Sed組顯著升高，推測長期有氧運動可激活AMPK-PGC-1α信號通路，促進心肌線粒體生物合成[15]。臨床研究指出，運動能力下降、易疲勞和肌無力是影響HF患者生活質(zhì)量的主要因素，這與HF時心輸出量和最大攝氧量(VO2max)降低以及有氧代謝能力下降密切相關。而PGC-1α上調(diào)使線粒體容積密度增加并與 HF患者VO2max和無氧閾的變化正相關[16]。因此，運動誘導AMPK-PGC-1α上調(diào)改善了HF時能量產(chǎn)生，心臟收縮功能和有氧能力(VO2max)隨之提高[17]，為代謝性重塑的良性變化奠定了物質(zhì)基礎。

2)運動活化AMPK-PPARα信號通路與FA代謝。

FA是正常心肌安靜時的主要能量底物，PPARα能夠調(diào)控編碼心肌線粒體大部分 FA氧化酶的基因表達[18]，其中CPT-1催化長鏈FA進入線粒體，是決定FA氧化的限速酶之一。最新的研究指出，PPARα是AMPK下游的靶分子，即AMPK可上調(diào)PPARα表達，兩者構成AMPK-PPARα信號通路，對維持心肌能量代謝穩(wěn)態(tài)發(fā)揮重要作用[19-20]。此外，AMPK還可激活PGC1α，PGC1α作為轉錄協(xié)同激活因子，與PPARα結合促進FA代謝酶的表達。

研究證實，壓力過負荷HF模型8周后，PPARα mRNA和蛋白水平均顯著低于對照組[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，雖然MI-Sed組AMPK有一定程度升高，但PPARα mRNA在MI-Sed組顯著低于Sham組，提示少量活化的AMPK不足以上調(diào)PPARα或者存在其他網(wǎng)絡式信號轉導途徑(如PGC1α下調(diào))。伴隨CPT-1的表達下調(diào)，心肌FA含量顯著升高，這是HF時FA利用減少的重要分子機制。HF時FA供能減少，一方面，可減少缺血缺氧狀態(tài)下心肌氧耗(FA氧化耗氧量多于葡萄糖)，但同時可造成脂質(zhì)在心臟沉積，誘導心肌細胞凋亡和脂毒性心臟異常。臨床研究發(fā)現(xiàn)，HF患者心肌內(nèi)出現(xiàn)明顯的脂質(zhì)沉積，而且心肌細胞間脂質(zhì)沉積與收縮功能失調(diào)及心功能衰竭有關[2]。

耐力運動可上調(diào)心臟 PPARα表達水平[21]，與本研究結果一致，即經(jīng)過8周有氧運動，MI-Ex組PPARα、CPT-1 mRNA水平顯著高于MI-Sed組，說明長期有氧運動激活了 AMPK-PPARα信號通路，加之 PGC1 α上調(diào)、線粒體生物合成增加使心肌能夠更有效的氧化、利用FA供能，心臟FA含量顯著降低，減輕了心臟脂質(zhì)沉積并改善脂毒性心臟異常。

3)運動活化 AMPK-GLUT4信號通路與葡萄糖代謝。

葡萄糖代謝約占正常心肌能量代謝的1/3。AMPK可通過上調(diào) GLUT4表達以及轉位而促進葡萄糖攝取并增強糖酵解作用[22]。本研究發(fā)現(xiàn)，HF時GLUT4蛋白表達下調(diào)，這與Tian等[19]的研究結果一致，他們還發(fā)現(xiàn)，雖然GLUT4總蛋白降低，但肌膜上的GLUT4占總蛋白的百分比卻增加，提示HF時AMPK代償性增加可促進 GLUT4向肌膜轉位，從而增加葡萄糖攝取。然而由于 GULT4總量減少，GLUT4在肌膜的相對增多并不能滿足HF時心肌的能量供應。HF時糖酵解效率明顯增強，心肌糖原含量減少，乳酸堆積增多、酸中毒進一步影響心功能[23]。

一次急性運動可上調(diào)GLUT4表達[24]，其意義在于通過增強糖酵解作用及時為心肌提供能量(糖酵解供能效率均較 FA和糖有氧氧化高)。但長期運動上調(diào)GLUT4表達的意義可能不同于一次急性運動。在本研究中，MI-Ex組GLUT4蛋白水平顯著高于MI-Sed組，提示長期有氧運動通過活化AMPK促進GLUT4表達，葡萄糖攝取增加。與此同時，MI-Ex組心肌乳酸含量較MI-Sed組顯著性降低(但仍高于Sham組)，說明長期有氧運動促使HF時糖酵解供能向糖有氧氧化供能轉變。其可能機制是長期運動通過增加線粒體生物合成、舒張血管(特別是冠狀動脈)增加血流量，機體的有氧代謝能力增強，同時FA氧化利用增加又可通過葡萄糖-脂肪酸循環(huán)[25]抑制糖酵解的關鍵酶——丙酮酸脫氧酶和磷酸果糖激酶，使糖酵解供能逐漸轉向糖有氧氧化供能。因此，心肌乳酸堆積減少，心功能隨之改善。

HF時心肌能量代謝的特點是由優(yōu)先利用FA轉變?yōu)樘墙徒夤┠転橹鞑⒃斐伤嶂卸竞椭|(zhì)沉積，同時線粒體生物合成減少，隨著HF發(fā)展進程，脂肪酸與葡萄糖的利用均顯著下降；運動則使FA氧化、葡萄糖利用以及線粒體生物合成均增加，這是心肌對長期訓練適應的結果。

綜上所述，長期有氧運動通過激活AMPK及其下游信號通路改善了HF心臟的代謝性重塑并提高運動心功能。

[1] van B M，van N F A，der Vusse G J. Metabolic remodelling of the failing heart: beneficial or detrimen-tal?[J]. Cardiovasc Res，2009，81(3)：420-428.

[2] Sharma S，Adrogue J V，Golfman L，et al. Intramyocardial lipid accumulation in the failing human heart resembles the lipotoxic rat heart[J]. FASEB J，2004，18(14)：1692-1700.

[3] Garnier A，F(xiàn)ortin D，Delomenie C，et al. Depressed mitochondrial transcription factors and oxidative capacity in rat failing cardiac and skeletal muscles[J]. J Physiol，2003，551(Pt 2)：491-501.

[4] Neubauer S. The failing heart-an engine out of fuel[J].N Engl J Med，2007，356(11)：1140-1151.

[5] Kim A S，Miller E J，Young L H. AMP-activated protein kinase: a core signalling pathway in the heart[J].Acta Physiol (Oxf)，2009，196(1)：37-53.

[6] Coven D L，Hu X，Cong L，et al. Physiological role of AMP-activated protein kinase in the heart: graded activation during exercise[J]. Am J Physiol Endocrinol Metab，2003，285(3)：E629-636.

[7] Musi N，Hirshman M F，Arad M，et al. Functional role of AMP-activated protein kinase in the heart during exercise[J]. FEBS Lett，2005，579(10)：2045-2050.

[8] Keteyian S J. Exercise training in congestive heart failure: risks and benefits[J]. Prog Cardiovasc Dis，2011，53(6)：419-428.

[9] Yeh G Y，McCarthy E P，Wayne P M，et al. Tai chi exercise in patients with chronic heart failure: a randomized clinical trial[J]. Arch Intern Med，2011，171(8)：750-757.

[10] Lopaschuk G D. AMP-activated protein kinase control of energy metabolism in the ischemic heart[J]. Int J Obes (Lond)，2008，32(Suppl 4)：S29-35.

[11] Langfort J，Viese M，Ploug T，et al. Time course of GLUT4 and AMPK protein expression in human skeletal muscle during one month of physical training[J]. Scand J Med Sci Sports，2003，13(3)：169-174.

[12] Takekoshi K，F(xiàn)ukuhara M，Quin Z，et al. Long-term exercise stimulates adenosine monophosphate-activated protein kinase activity and subunit expression in rat visceral adipose tissue and liver[J]. Metabolism，2006，55(8)：1122-1128.

[13] 韓雨梅，張勇. PGC-1α在運動誘導骨骼肌線粒體生物合成中的調(diào)控作用[J]. 中國運動醫(yī)學雜志，2010，29(4)：494-497.

[14] Scarpulla R C. Metabolic control of mitochondrial biogenesis through the PGC-1 family regulatory network[J].Biochim Biophys Acta，2011，1813(7)：1269-1278.

[15] Kemi O J，Hoydal M A，Haram P M，et al. Exercise training restores aerobic capacity and energy transfer systems in heart failure treated with losartan[J]. Cardiovasc Res，2007，76(1)：91-99.

[16] Garnier A，F(xiàn)ortin D，Zoll J，et al. Coordinated changes in mitochondrial function and biogenesis in healthy and diseased human skeletal muscle[J]. FASEB J，2005，19(1)：43-52.

[17] Wisloff U，Loennechen J P，Currie S，et al. Aerobic exercise reduces cardiomyocyte hypertrophy and increases contractility，Ca2+sensitivity and SERCA-2 in rat after myocardial infarction[J]. Cardiovasc Res，2002，54(1)：162-174.

[18] Madrazo J A，Kelly D P. The PPAR trio: regulators of myocardial energy metabolism in health and disease[J]. J Mol Cell Cardiol，2008，44(6)：968-975.

[19] Meng R S，Pei Z H，Yin R，et al. Adenosine monophosphate-activated protein kinase inhibits cardiac hypertrophy through reactivating peroxisome proliferator-activated receptor-alpha signaling pathway[J]. Eur J Pharmacol，2009，620(1-3)：63-70.

[20] Meng R，Pei Z，Zhang A，et al. AMPK activation enhances PPARalpha activity to inhibit cardiac hypertrophy via ERK1/2 MAPK signaling pathway[J]. Arch Biochem Biophys，2011，511(1-2)：1-7.

[21] 方子龍，陳敏，張志文，等. 耐力訓練和注射丙酸睪酮對雄性大鼠肝臟、心臟和腓腸肌PPARα表達的影響[J]. 天津體育學院學報，2006，21(3)：197-200.

[22] Bergeron R，Shulman G I. Translocation of myocardial GLUT-4 and increased glucose uptake through activation of AMPK by AICAR[J]. Am J Physiol，1999，277(2 Pt 2)：H643-649.

[23] Dolinsky V W，Dyck J R. Role of AMP-activated protein kinase in healthy and diseased hearts[J]. Am J Physiol Heart Circ Physiol，2006，291(6)：H2557-2569.

[24] 龔豪杰，謝謹，張楠，等. 不同強度運動對AMPKα2三種不同基因狀態(tài)鼠MEF2/GLUT4DNA結合活性的影響[J]. 體育科學，2011，31(2)：55-63.

[25] 房冬梅，馮美云. 運動對心肌組織能量代謝的影響[J]. 體育科研，2002，23(4)：16-18.