朱皓皞 杜麗英 熊敦勇 寇 輝 王芳勝

彌漫性大B細胞淋巴瘤(diffuse large B cell lymphoma，DLBCL)是成人中最常見的一型淋巴瘤，占西方國家成人非霍奇金淋巴瘤的25% ～30%，在發(fā)展中國家還要高些［1］。治療DLBCL傳統(tǒng)的CHOP化療方案(環(huán)磷酰胺、阿霉素、長春新堿及強的松)5年存活率為30% ～49%［2］，仍有部分患者預后較差，因此需要進一步確定預后因素及治療的靶目標。本實驗采用免疫組織化學SP法檢測DLBCL中 E2F-1、NF-κB/P65和P-gp的表達，探討其在DLBCL中表達的相關性，并結合臨床資料及隨訪資料分析它們與臨床病理特征及預后的關系。

1 材料與方法

1.1 一般資料

61例DLBCL組織石蠟標本取自解放軍第九四醫(yī)院2006年6月～2011年10月初治的DLBCL患者。所有病理切片經(jīng)2位有經(jīng)驗的病理醫(yī)師復核，符合WHO的診斷標準。所入選的病例均接受了2周期或以上的CHOP方案為基礎的聯(lián)合化療，加或不加放療。全組患者男性32例，女性29例;年齡13～80歲，中位年齡53歲，平均年齡49.6歲;采用Ann Arbor分期，其中Ⅰ～Ⅱ期33例，Ⅲ～Ⅳ期28例;有B癥狀者20例，無B癥狀者41例;LDH值≥300 IU/L者25例，LDH值＜300 IU/L者36例;IPI值低危者31例，低中危者10例，中高危者16例，高危者4例。這61例患者中，隨訪到生存資料可作回顧性分析的有26例，其中男性11例，女性15例;年齡13～80歲，中位年齡54.5歲，平均年齡50.46歲;采用Ann Arbor分期，其中Ⅰ～Ⅱ期14例，Ⅲ～Ⅳ期12例;有B癥狀者9例，無B癥狀者17例;IPI值低危者11例，低中危者5例，中高危者8例，高危者2例。26例患者中存活15例，死亡11例，5年存活率57.7%。另選15例同期反應性增生的淋巴結作為對照組。所有標本采用10%中性福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋，4 μm厚連續(xù)切片。

1.2 試劑與方法

即用型E2F-1鼠抗人單克隆抗體，購自上海長島生物技術有限公司。即用型NF-ΚB/P65鼠抗人多克隆抗體，購自北京中杉金橋生物技術有限公司。即用型P-gp鼠抗人單克隆抗體，購自福州邁新生物技術有限公司。免疫組化SP兩步法具體試驗步驟按試劑盒說明書進行，以PBS代替一抗做陰性對照，已知陽性結果做陽性對照。

1.3 結果判斷

E2F-1表達以細胞核內出現(xiàn)棕黃色顆粒，且陽性細胞數(shù) ＞10% 為“+ ”［3］。NF-κB/P65:細胞質或胞核內出現(xiàn)棕黃色顆粒，且陽性細胞數(shù) ＞50%為“+”［4］。P-gp:細胞膜或細胞質內出現(xiàn)棕黃色顆粒，陽性細胞數(shù)＞10%為“+”［5］。

1.4 隨訪

隨訪采用病歷跟蹤、電話隨訪及信函隨訪的方式，生存期的計算從確診到隨訪截止日期(2012年6月30日)，或死亡的日期為止，所有病例平均隨訪時間為36個月(6～60個月)。

1.5 統(tǒng)計學方法

采用SPSS13.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，各組間樣本率的比較采用卡方檢驗及Fisher確切概率法;E2F-1、NF-κB/P65、P-gp表達的相關性采用Spearman秩和相關分析;5年生存率的統(tǒng)計采用Kaplan-Meier生存分析(組間比較采用Log Rank檢驗)。

2 結果

2.1 E2F-1、NF-κB/P65、P-gp 在 DLBCL 中的表達

E2F-1、NF-κB/P65、P-gp 在 DLBCL 中的陽性表達率分別為 42.6%(26/61)、52.5%(32/61)、54.1%(33/61);在對照組淋巴結反應性增生中陽性表達率分別為 80.0%(12/15)、0(0/15)、13.3%(2/15)，組間差異均有統(tǒng)計學意義，P＜0.05(表1)。

表1 E2F-1、NF-κB/P65、P-gp在反應性增生淋巴結和 DLBCL組織中的陽性表達(例，%)

2.2 DLBCL 中 E2F-1、NF-κB/P65 和 P-gp 表達的相關分析

E2F-1和NF-κB/P65在DLBCL中的表達呈明顯負相關(γ = －0.507，P ＜0.05，表 2)。NF-κB/P65 和P-gp在DLBCL中的表達呈明顯正相關(γ=0.638，P＜0.05)。E2F-1和P-gp兩者在DLBCL中的表達呈明顯負相關(γ = －0.404，P ＜0.05)，見表2，3。

2.3 E2F-1 、NF-κB/P65 和 P-gp與臨床特征的關系

在61例DLBCL組織中，E2F-1陽性表達與性別、年齡、Ann Arbor分期、IPI評分、LDH值及B癥狀均無關(P ＞0.05)。NF-κB/P65 陽性表達與 Ann Arbor分期及IPI評分有關，與性別、年齡、LDH值及B癥狀均無關(P＞0.05)。P-gp陽性表達與IPI評分有關，與性別、年齡、Ann Arbor分期、LDH值及B癥狀均無關(P ＞0.05)，見表 4。

表2 DLBCL中E2F-1與NF-κB/P65、P-gp表達的相關性(例)

表3 DLBCL中NF-κB/P65與P-gp表達的相關性(例)

表4 DLBCL組織中、NF-κB/P65、P-gp的表達與臨床病理特征的關系(例，%)

2.4 E2F-1 、NF-κB/P65 和 P-gp與預后的關系

E2F-1陽性表達者5年生存率明顯高于E2F-1陰性者，兩組間差異有統(tǒng)計學意義(P=0.03)。NF-κB/P65陽性表達者5年生存率明顯低于NF-κB/P65陰性表達者，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.01)。P-gp陽性表達者的5年生存率雖然低于P-gp陰性表達者，但差異不具有統(tǒng)計學意義(P=0.12)，見圖1～3。

圖1 E2F-1的表達與預后的關系

圖2 NF-κB/P65的表達與預后的關系

圖3 P-gp的表達與預后的關系

3 討論

3.1 E2F-1在DLBCL中的表達及意義

E2F-1最初是由Rovesdi等在研究腺病毒時發(fā)現(xiàn)的，它對于E2基因啟動子的激活是必需的［6］。研究表明E2F-1是1個致瘤基因。Suh等［7］對72例卵巢上皮腫瘤進行研究時發(fā)現(xiàn)45.8%的患者高表達E2F-1，且E2F-1的過表達與分裂指數(shù)有關，是1個預后不良的指標。Ebihara等［8］對122例食管鱗狀細胞癌患者的研究發(fā)現(xiàn)73例患者過表達E2F-1，E2F-1與腫瘤的進展有關，高表達E2F-1的患者手術后預后不良。E2F-1的過表達還可以提高人類頭頸部腫瘤細胞株的侵襲性［9］。這些都表明E2F-1在腫瘤中發(fā)揮了癌基因的作用，E2F-1的這種作用可能與E2F-1能夠促進與DNA復制和G1/S期轉化有關的靶基因的轉錄及表達，促進細胞進入S期從而促進細胞增殖有關。之前的研究結果表明 E2F-1的陽性率為 34% ～83%［3，10］，本實驗結果符合文獻報道。本實驗同時發(fā)現(xiàn)15例反應性增生的淋巴結中有12例陽性表達，陽性表達率為80%，兩者的表達差異具有統(tǒng)計學意義，表明E2F-1的低表達可能與DLBCL的形成有關。進一步研究發(fā)現(xiàn)E2F-1陽性表達者的5年生存率明顯高于E2F-1陰性表達者，它們之間的差異具有統(tǒng)計學意義，提示E2F-1可以作為判斷腫瘤預后的1個指標，這個結果與Moller等的研究結果一致［3］。

3.2 NF-ΚB/P65在DLBCL中的表達及意義

核轉錄因子NF-κB是1種可以與免疫球蛋白(Ig)κ輕鏈基因的增強子的κB序列(GGGACTITCC)特異性結合的核蛋白因子，不僅在免疫反應和炎癥反應中發(fā)揮了重要作用，近年來的研究表明NF-κB在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中也發(fā)揮了重要的作用。Aranha等［11］的研究表明NF-κB的激活在結直腸腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要作用，其在結直腸腫瘤組織中的陽性率明顯高于正常結直腸黏膜，且從腺瘤到低分化腺癌NF-κB/RelA 的陽性率逐漸增高。Davis等［12］的研究表明NF-κB的持續(xù)性活化對于活化的B細胞樣彌漫性大B細胞淋巴瘤細胞(ABC-DLBCL)株的生存是必須的，ABC-DLBCL患者擁有1個不好的預后，本研究結果也表明NF-κB是1個預后不良的指標。在我們的實驗中，61例DLBCL中有32例陽性表達，陽性表達率為52.5%;15例反應性增生的淋巴結均不表達，進一步研究發(fā)現(xiàn)，NF-κB/P65的陽性表達與Ann Arbor分期晚及IPI評分高有關，提示NF-κB/P65的陽性表達可能與DLBCL的發(fā)生發(fā)展相關，NF-κB/P65的激活可能可以促進DLBCL的侵襲性發(fā)展。生存分析發(fā)現(xiàn)，NF-κB/P65陽性表達者的5年生存率明顯低于 NF-κB/P65陰性表達者，它們之間的差異具有統(tǒng)計學意義，表明NF-κB是1個預后不良的指標。

3.3 P-gp在彌漫性大B細胞淋巴瘤中的表達及意義

DLBCL患者以化療為主，雖然DLBCL為化療敏感的淋巴瘤，但仍有一部分患者不能治愈。近年來研究表明腫瘤細胞對抗癌藥物產(chǎn)生多藥耐藥是影響腫瘤治愈的主要原因之一。在多藥耐藥機制中研究的最多的是由MDR1基因編碼的P-gp。P-gp不僅在正常組織中存在，在腫瘤細胞中也有表達，P-gp的表達與蒽環(huán)類抗生素、長春堿類、紫杉醇類、鬼臼毒素類等化療藥物的耐藥有關。本組研究發(fā)現(xiàn)61例DLBCL患者中P-gp的陽性率為54.1%，這說明彌漫性大B細胞瘤中存在著一定程度的原發(fā)性多藥耐藥。對于P-gp陽性的患者應合理選擇化療藥物，避免使用與P-gp介導的MDR有關的抗腫瘤藥物，同時可聯(lián)合使用耐藥逆轉治療，最終達到治愈淋巴瘤的目的。另外本研究同時表明P-gp的表達與DLBCL患者的預后無關，這個結果與Masahiko等［5］的研究一致。

3.4 DLBCL 中 E2F-1、NF-κB/P65 和 P-gp 表達的相互關系

本實驗發(fā)現(xiàn)在 DLBCL組織中 E2F-1和 NF-κB/P65之間表達呈顯著負相關，表明E2F-1可以抑制NF-κB/P65的活性，從而發(fā)揮它的促凋亡作用，這與國內外現(xiàn)有研究結果相符。Phillips等［13］的研究表明E2F-1可以通過抑制IκB激酶的活性而抑制NF-κB的活性來促進凋亡，該研究同時表明E2F-1可以減少TRAF2，而TRAF2能夠參與了NF-κB的活化。本實驗也發(fā)現(xiàn)NF-κB與P-gp之間存在顯著正相關，表明NF-κB參與了腫瘤的多藥耐藥。NF-κB是重要的核轉錄因子，它調控著許多基因包括MDR1基因的表達。Kuo等［14］在MDR1促進子上發(fā)現(xiàn)了1個NF-κB結合位點，用胰島素能夠刺激NF-κB亞基P50(P65)在核內與該位點結合，促進MDR1表達。在K562/A02細胞株中P-gp和MDR1與NF-κB/p65呈正相關，通過抑制NF-κB可以減少MDR1 mRNA和P-gp的表達［15］。這些證據(jù)都表明NF-κB可以通過促進P-gp的表達而參與耐藥的發(fā)生。

本研究還發(fā)現(xiàn)DLBCL組織中E2F-1與P-gp存在顯著負相關，可能是E2F-1抑制了NF-κB的活性，從而使P-gp表達減少，增加了腫瘤對化療的敏感性，抑制了多藥耐藥的發(fā)生。最近的研究也表明，在一些腫瘤中E2F-1的過表達與化療的敏感性呈正相關，Russo等［16］的研究表明在骨肉瘤細胞株中，E2F-1的過表達顯著地增加了細胞對紫杉堿和長春堿的敏感性。

綜上所述，E2F-1和 NF-κB/P65的表達水平與DLBCL患者的預后密切相關，而P-gp則與預后無關。本研究同時發(fā)現(xiàn)DLBCL患者中存在一定程度的原發(fā)性多藥耐藥。

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