呂曉虹 李偉 何嵐 王懷宇 蒲丹 孫怡寧 周文旭

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid Arthritis ,RA)是一種以對(duì)稱性、侵蝕性關(guān)節(jié)滑膜炎為特征的慢性、系統(tǒng)性自身免疫疾病, 炎癥為RA發(fā)病機(jī)制的中心環(huán)節(jié)。泛素-蛋白酶體途徑(ubiquitin-proteasome pathway , UPP)是真核細(xì)胞內(nèi)重要的非溶酶體蛋白降解途徑, 20S蛋白酶體是UPP中具有蛋白酶催化活性的核心顆粒。UPP通過調(diào)控多種炎癥調(diào)節(jié)蛋白, 在炎癥過程中發(fā)揮著重要作用［1］。研究顯示RA患者血清蛋白酶體及其自身抗體濃度升高, 蛋白酶體抑制劑可緩解關(guān)節(jié)炎大鼠病情進(jìn)展［2］, 提示蛋白酶體參與了RA的發(fā)生、發(fā)展。關(guān)節(jié)滑膜中炎癥浸潤細(xì)胞主要來源于外周血細(xì)胞［3］, 循環(huán)單核細(xì)胞在RA發(fā)病機(jī)制中具重要作用［4,5］。RA患者外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)是否存在蛋白酶體表達(dá)及功能異常目前尚未見報(bào)道, 本課題通過檢測RA患者20S蛋白酶體蛋白表達(dá)水平, 對(duì)該問題進(jìn)行了初步探討。

1 研究對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 臨床確診的RA患者30例, 來自西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院風(fēng)濕科住院患者, RA診斷參照1987年美國風(fēng)濕病協(xié)會(huì)分類診斷標(biāo)準(zhǔn)。健康對(duì)照28例, 來自西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院體檢中心健康體檢人員, 排除自身免疫病性疾病。兩組研究對(duì)象均排除心、腦、肝、腎疾??；急、慢性感染；惡性腫瘤等疾病。

1.2 研究方法

1.2.1 一般臨床資料 記錄所有研究對(duì)象性別、年齡, RA患者記錄病程, 檢測類風(fēng)濕因子、C-反應(yīng)蛋白(C-reactive protein, CRP)、紅細(xì)胞沉降率(ehythrocyte sedimention rate,ESR)、自身抗體, 計(jì)算發(fā)病時(shí)的疾病活動(dòng)性評(píng)分DAS28。

1.2.2 PBMC的分離與純化 取受試者空腹外周靜脈血5 ml,加肝素鈉抗凝(3.8 μl/ml)。采用淋巴細(xì)胞分離液(上海華精)密度梯度法分離PBMC。

1.2.3 20S蛋白酶體C2亞基蛋白表達(dá)測定 采用Western印跡法測定PBMC中20S蛋白酶體C2亞基蛋白表達(dá)水平。RIPA裂解液裂解PBMC, 吸取上清液獲細(xì)胞蛋白裂解液。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳, 電轉(zhuǎn)印至NC膜。5%BSA封閉液,37℃封閉NC膜1 h。分別加入稀釋的一抗：proteasome 20S C2 Rabbit Ab (1:1000, Abcam), Rabbit Anti-β-actin(1:400, 北京博奧森), 4℃過夜。TBST洗膜5 min×3次, 加入稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG(1:8000, 北京博奧森), 37℃孵育2 h。TBST洗膜5 min×3次。等比例混合ECL發(fā)光液(Pierce Biotechnology), NC膜孵育5 min, 曝光, 凝膠成像分析系統(tǒng)成像保存。所得圖像導(dǎo)入Quantity One生物醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行圖像分析處理, 蛋白含量以條帶的積分光密度值表示。目的條帶和內(nèi)參照β-actin條帶IOD值的比值為目的片段的光密度比值, 表示檢測蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 一般臨床資料 RA患者30例(男性3例, 女性27例),年齡 (46.67±11.97)歲, 病程(6.96±3.65)年, ESR (50.55±35.02)mm/h, CRP (27.82±23.10 )mg/L, RF (90.72±74.60 )IU/ml,DAS28評(píng)分(4.89±1.60)。健康對(duì)照30例(男性5例, 女性23例), 年齡 (41.04±11.17)歲。RA與正常對(duì)照之間年齡差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2 20S蛋白酶體C2亞基蛋白表達(dá) 20S蛋白酶體C2亞基蛋白表達(dá)水平用Western-Blot灰度值表示(圖1)。RA患者PBMC中20S蛋白酶體C2亞基表達(dá)水平高于正常對(duì)照組［(2.92±1.41)VS (0.65±0.42), P<0.01)］差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 Western-Blot檢測20S蛋白酶體C2亞基蛋白表達(dá), 以β-Actin作為內(nèi)參照

2.3 相關(guān)性分析 分別對(duì)RA患者20S蛋白酶體C2亞基表達(dá)與DAS28、CRP、ERS指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析, 結(jié)果顯示RA患者蛋白酶體C2亞基表達(dá)水平與DAS28、CRP、ERS之間無顯著相關(guān)性。

3 討論

UPP是真核生物細(xì)胞中一種高效的蛋白分解途徑, 具廣泛的生物學(xué)作用。蛋白酶體是依賴ATP的蛋白水解酶復(fù)合物,是真核細(xì)胞中分解內(nèi)源性蛋白質(zhì)的主要酶系統(tǒng), 也是UPP的核心部分。蛋白酶體由20S蛋白酶體和調(diào)節(jié)顆粒組成, 主要降解一些短壽命的蛋白、變性蛋白、癌基因產(chǎn)物蛋白等, 對(duì)維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)和生物學(xué)效應(yīng)起到了重要作用, 也參與了免疫炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)［1］。

UPP與疾病關(guān)系的探討是目前研究的熱點(diǎn), 其功能異常與多種人類疾病相關(guān), 包括自身免疫病和炎癥［6］。研究發(fā)現(xiàn),在系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、原發(fā)性干燥綜合癥(PSS)、強(qiáng)直性脊柱炎(AS)、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)、多發(fā)性肌炎/皮肌炎(PM/DM)等多種結(jié)締組織病中存在著蛋白酶體的異常［7,8］。上述研究主要集中在血清蛋白酶體或其抗體的檢測。

RA關(guān)節(jié)滑膜中炎癥浸潤細(xì)胞主要來源于外周血白細(xì)胞,PBMC可反映整體的炎癥狀態(tài)［9］, 而UPP通過調(diào)控多種炎癥調(diào)節(jié)蛋白在炎癥過程中發(fā)揮著重要作用。因此, 觀察RA患者PBMC中蛋白酶體的變化對(duì)于探討蛋白酶體在RA 發(fā)病機(jī)制的作用具有重要意義。本研究首次發(fā)現(xiàn)RA患者PBMC中20S蛋白酶體C2亞基表達(dá)水平顯著高于正常人群, 具統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。該結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了蛋白酶體與RA的發(fā)生具有密切聯(lián)系, 但其在RA發(fā)病機(jī)制中的具體作用還有待進(jìn)一步研究。

隨著對(duì)UPP病理生理作用的深入研究, 蛋白酶體抑制劑的臨床應(yīng)用和開發(fā)受到日益重視。蛋白酶體抑制劑bortezomib已經(jīng)用于對(duì)多發(fā)性骨髓瘤的臨床治療, 并顯示了其有效性?；诘鞍酌阁w抑制劑強(qiáng)大的抗炎、抑制細(xì)胞增殖及促進(jìn)凋亡的作用, 有學(xué)者提出其在RA等炎性疾病的治療中具有良好的應(yīng)用前景［2,5］。體外和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)蛋白酶體抑制劑可抑制活化的T細(xì)胞釋放炎癥因子［10］緩解關(guān)節(jié)炎大鼠的病情進(jìn)展［2］, 但是否可真正應(yīng)用于臨床患者還需要大量的研究。本研究為應(yīng)用蛋白酶體抑制劑治療RA提供了一定的理論依據(jù)。

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