★ 李素梅 陳雪婷 李養(yǎng)學(xué) 程青云 (.廣東省中醫(yī)研究所 廣州50095;.廣州中醫(yī)藥大學(xué)廣州50405)

柴芍疏肝顆粒由柴胡、白芍、當(dāng)歸等中藥組成，具有疏肝解郁、養(yǎng)血健脾、行氣止痛散結(jié)等功效。適用于肝郁氣滯型等良性乳腺疾病，甲狀腺良性疾病等。為了更好地控制其質(zhì)量，保證其臨床療效，本實(shí)驗(yàn)采用TLC法對(duì)其中所含柴胡、白芍、當(dāng)歸進(jìn)行定性鑒別，采用HPLC法對(duì)方中所含芍藥苷進(jìn)行含量測(cè)定。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

CAMAG TLC SAMPLER 4型自動(dòng)點(diǎn)樣儀(瑞士);CAMAG Reprostar3薄層成像系統(tǒng)(瑞士);Agilent 1200高效液相色譜儀(美國(guó));Mettler XS205DU電子分析天平(瑞士);KQ5200 DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山);電熱恒溫水浴槽(上海);DHG－9070A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海);PBQ－Ⅱ型薄層自動(dòng)鋪板器(重慶)。

1.2 試藥

柴胡對(duì)照藥材(批號(hào):120992－200504)、白芍對(duì)照藥材(批號(hào):120905－200508)、當(dāng)歸對(duì)照藥材(批號(hào):120927－200512)、芍藥苷對(duì)照品(批號(hào)110736－201035)，均購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所;柴芍疏肝顆粒(批號(hào):110303、110304、110305，由廣東省第二中醫(yī)院制劑室提供);乙腈為色譜純，水為超純水，其他試劑均為分析純。

2 薄層色譜定性鑒別

2.1 柴胡定性鑒別［1－2］

取本品研細(xì)粉末5 g，加甲醇30 mL，超聲處理30分鐘，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)铀?0 mL使溶解，加水飽和正丁醇振搖提取2次，每次30 mL，合并正丁醇液，加氨試液40 mL洗滌，棄去氨試液，正丁醇液蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液。另取柴胡對(duì)照藥材1 g，加水50 mL，煮沸30分鐘，放冷，濾過(guò)，濾液加水飽和正丁醇振搖提取2次，同法制成柴胡對(duì)照藥材溶液。再取缺柴胡的陰性樣品5 g，按供試品溶液制備方法制成陰性對(duì)照溶液。照薄層色譜法(《中國(guó)藥典》2010年版一部附錄Ⅵ B)試驗(yàn)，吸取上述供試品溶液15 μL、柴胡對(duì)照藥材溶液5 μL，陰性照溶液15 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G 薄層板上，以正丁醇－乙酸乙酯－稀氨水(1→10)(4∶1∶5)的上層溶液為展開(kāi)劑，置氨蒸氣飽和的展開(kāi)槽中，展開(kāi)，取出，晾干，噴以1%對(duì)二甲氨基苯甲醛的硫酸乙醇溶液(1→10)，105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，紫外光燈(365 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，陰性對(duì)照無(wú)干擾(見(jiàn)圖1)。

圖1 柴胡TLC圖譜(1 ～3、供試品，4、柴胡對(duì)照藥材，5、柴胡陰性對(duì)照)

2.2 白芍定性鑒別

取本品研細(xì)粉末5 g，加甲醇30 mL，超聲處理30分鐘，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液。另取白芍對(duì)照藥材1 g，加甲醇30 mL，同法制成白芍對(duì)照藥材溶液。再取缺白芍的陰性樣品5 g，同供試品溶液制備方法制成陰性對(duì)照溶液。照薄層色譜法(《中國(guó)藥典》2010年版一部附錄ⅥB)試驗(yàn)，吸取上述供試品溶液、白芍對(duì)照藥材溶液、陰性對(duì)照溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一用1%氫氧化鈉溶液制備的硅膠G薄層板上，以環(huán)己烷－乙酸乙酯－甲酸 －冰乙酸(7∶2∶0.2∶0.2)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以5%香草醛硫酸溶液，105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)位置上，顯相同顏色斑點(diǎn)，陰性對(duì)照無(wú)干擾，見(jiàn)圖2。

2.3 當(dāng)歸定性鑒別［3］

圖2 白芍TLC圖譜(1 ～3、供試品，4、白芍對(duì)照藥材，5、白芍陰性對(duì)照)

取本品研細(xì)粉末3 g，加甲醇30 mL，超聲處理30分鐘，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)铀?0 mL使溶解(必要時(shí)濾過(guò))，濾液加乙醚振搖提取2次，每次20 mL，合并乙醚液，蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液。另取當(dāng)歸對(duì)照藥材0.5 g，加乙醚20 mL，超聲處理10分鐘，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為對(duì)照藥材溶液。再取缺當(dāng)歸的陰性樣品3 g，同供試品溶液制備方法制成陰性對(duì)照溶液。照薄層色譜法(《中國(guó)藥典》2010年版一部附錄ⅥB)試驗(yàn)，吸取上述供試品溶液、陰性對(duì)照溶液各2 μL、對(duì)照藥材溶液4 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠 G薄層板上，以正己烷—乙酸乙酯(4:1)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，置紫外燈(365 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，陰性對(duì)照無(wú)干擾，見(jiàn)圖3。

圖3 當(dāng)歸TLC圖譜(1 ～3、供試品，4、當(dāng)歸對(duì)照藥材，5、當(dāng)歸陰性對(duì)照)

3 芍藥苷含量測(cè)定［4］

3.1 色譜條件

色譜柱:Agilent Extend C18柱(4.6mm×250mm，5 μm);流動(dòng)相:乙腈 －0.1%磷酸水溶液(14∶86);波長(zhǎng):230 nm;流速1 mL/分;柱溫:25℃。理論板數(shù)按芍藥苷峰計(jì)算應(yīng)不低于2 000。

3.2 對(duì)照品溶液的制備

取芍藥苷對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，加甲醇制成每1mL含96.5 μg的溶液，即得。

3.3 供試品溶液的制備

取本品研細(xì)粉末約2 g，精密稱(chēng)定，置具塞錐形瓶中，精密加入稀乙醇50 mL，超聲處理30分鐘，取出，放冷，再稱(chēng)定重量，用稀乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

3.4 方法學(xué)考察

3.4.1 陰性干擾試驗(yàn) 取缺白芍的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制成陰性對(duì)照溶液，進(jìn)樣，測(cè)定，結(jié)果表明，處方中其他藥味無(wú)干擾，色譜圖見(jiàn)圖4。

圖4 芍藥苷HPLC色譜圖1芍藥苷;A對(duì)照品HPLC色譜圖;B供試品HPLC色譜圖;C陰性對(duì)照HPLC色譜圖

3.4.2 線(xiàn)性關(guān)系考察 精密稱(chēng)取芍藥苷對(duì)照品12.88 mg，置100 mL量瓶中，加甲醇制成每1mL含0.1288mg芍藥苷的對(duì)照品溶液，從中分別精密吸取2、4、6、8、10mL，置10mL 量瓶中，加甲醇稀釋定容至刻度，搖勻，制成濃度分別為 25.76、51.52、77.28、103.04、128.8 μg/mL的對(duì)照品溶液。分別精密吸取上述對(duì)照品溶液10μL，注入液相色譜儀，按上述色譜條件測(cè)定，以對(duì)照品峰面積積分值(Y)為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量(X，μg)為橫坐標(biāo)進(jìn)行線(xiàn)性回歸，得回歸方程 Y=563.808 33X－0.739 124(r=0.999 9)，結(jié)果表明芍藥苷進(jìn)樣量在0.2576－1.288 μg范圍內(nèi)與峰面積積分值線(xiàn)性關(guān)系良好。

3.4.3 精密度考察 精密吸取對(duì)照品溶液(128.8 μg/mL)10 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，按照上述色譜條件測(cè)定，結(jié)果芍藥苷平均峰面積為 724.4377，RSD=0.21%(n=6)，表明儀器精密度良好。

3.4.4 重現(xiàn)性試驗(yàn) 取同一批樣品(批號(hào)110303)6份，按上述供試品溶液方法和色譜條件測(cè)定，結(jié)果芍藥苷平均含量為 2.42 mg/g，RSD=1.09%，(n=6)，表明方法重現(xiàn)性好。

3.4.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，分別在0、2、4、6、8、12 小時(shí)進(jìn)樣 10 μL，按上述色譜條件測(cè)定峰面積，結(jié)果芍藥苷峰面積 RSD為 RSD=0.34%，表明供試品溶液在12小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定性良好。3.4.6 加樣回收試驗(yàn) 取已知含量的樣品(批號(hào)110303)約1.0 g，6份，精密稱(chēng)定，加入一定量的芍藥苷對(duì)照品，按照供試品溶液制備方法處理樣品，進(jìn)樣10 μL，按上述色譜條件測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 芍藥苷加樣回收試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

3.4.7 樣品含量測(cè)定 取三批樣品(批號(hào)110303、110304、110305)約2 g，精密稱(chēng)定，按上述供試品溶液處理方法制備供試品溶液，分別精密吸取對(duì)照品溶液和供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，按上述色譜條件測(cè)定，以外標(biāo)法計(jì)算含量，三批樣品測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果

4 討論

薄層定性鑒別中，柴胡的鑒別曾參考《中國(guó)藥典》2010年版一部263頁(yè)柴胡鑒別項(xiàng)下方法，但背景較深，不利于鑒別。經(jīng)試驗(yàn)摸索，建立了文中所述柴胡TLC鑒別方法，斑點(diǎn)清晰，且陰性對(duì)照無(wú)干擾。

芍藥苷含量測(cè)定方法，參照2010版《中國(guó)藥典》一部白芍含量測(cè)定項(xiàng)下方法，結(jié)果芍藥苷分離較好，保留時(shí)間適宜，通過(guò)方法學(xué)考察，本方法準(zhǔn)確、可靠，可作為柴芍疏肝顆粒的含量測(cè)定方法。

本文所建立的方法操作簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確可靠，重現(xiàn)性好、可作為柴芍疏肝顆粒的質(zhì)量控制方法。

［1］王曉玲，郭奇慧.柴胡乳安膠囊質(zhì)量控制方法研究［J］.北方藥學(xué)，2011，8(5):13 －14.

［2］陳雪婷，李素梅，李養(yǎng)學(xué).祛風(fēng)健骨片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究［J］.今日藥學(xué)，2012，22(11):690 －692.

［3］國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典［S］.一部，北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010:124..

［4］國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典［S］.一部，北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010:96.