杜 麗 李 俐 林 玲 肖佳慶 譚金煜 孟 琳 尹世輝 孫 宏＊

1 黑龍江省疾病預(yù)防控制中心，哈爾濱 150030；

2 哈爾濱醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，哈爾濱 150081

隨著抗生素廣泛使用，CNS引起的醫(yī)院感染有逐年上升的趨勢，而且常表現(xiàn)出耐藥性甚至多重耐藥而造成難治性感染。人們研究發(fā)現(xiàn)隨著消毒劑在大量領(lǐng)域的使用，CNS的耐藥現(xiàn)象已不僅局限于抗生素，且已擴(kuò)展到了消毒劑。如何合理使用消毒劑已成為醫(yī)院感染管理的又一個難題。臨床標(biāo)本的多重耐藥監(jiān)測已經(jīng)引起重視，但醫(yī)院環(huán)境致病菌耐受消毒劑卻很少有人關(guān)注。本文通過對醫(yī)院環(huán)境分離的CNS進(jìn)行耐藥基因檢測以及與實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)菌株對乙醇消毒劑抗性的比較，為消毒劑與抗生素存在交叉耐藥的可能性提供參考，并為合理使用消毒劑加強(qiáng)醫(yī)院感染控制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

（1）菌株

本次所研究的試驗(yàn)菌株均來自2008～2009年醫(yī)療機(jī)構(gòu)環(huán)境物體表面及醫(yī)護(hù)人員手的樣本，樣本共計841份，質(zhì)控菌株為金黃色葡萄球菌ATCC25923和ATCC43300，（由中國菌種保藏中心提供）。金黃色葡萄球菌（ATCC6538）（由中國軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院消毒檢測中心提供）和qacA基因陽性凝固酶陰性葡萄球菌（TS77）（由重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院感染科賈蓓教授贈送）。

（2）儀器 PCR儀Labcycler，凝膠成像儀Gel DocXR（BIO-Rad），電泳系統(tǒng)JUNI JY600c，細(xì)菌生化鑒定儀WalkaWay-40s1，微量生化管由杭州天和生物有限公司生產(chǎn)。

（3）消毒劑

為＞99%分析乙醇，由天津市永大化學(xué)試劑開發(fā)中心生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本培養(yǎng)鑒定

對采集標(biāo)本進(jìn)行接種培養(yǎng)，從中分離出病原菌凝固酶陰性葡萄球菌（CNS），制備成標(biāo)本。用細(xì)菌生化鑒定儀做菌株鑒定。少數(shù)不能鑒定的菌株，采用微量生化管法進(jìn)行鑒定。

1.2.2 抗藥基因檢測

1.2.2.1 DNA模板液制備 用無菌槍頭挑取平板上數(shù)個新鮮菌落，置入200uL滅菌純水離心管中，充分混勻制成菌懸液，然后將盛裝此混合物的離心管置100℃煮沸10min后,在冰上短暫冷卻，13000r/min離心10min,上清液即為模板液。

1.2.2.2基因引物序列

引物 qacA：

qacA-F 5′-3′GCTGCA TTTA TGACAA TGTTTG；

qacA-R 5′-3′AATCCCACCTACTAAAGCAG 擴(kuò)增產(chǎn)物為629bp[3]。

引物mecA：

P1 : 5′GAAATGACTGAACGTCCG-3′；

P2:5′ACTTAGTTCTTTAGCGAT-3′擴(kuò)增產(chǎn)物為393bp[1]。

1.2.2.3 PCR熱循環(huán)參數(shù)

qacA反應(yīng)條件：93℃預(yù)熱2min；93℃30s，55℃ 30s，72℃60s，35個循環(huán)；72℃延伸5min。反應(yīng)結(jié)束后，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物置4℃ 保存。

mecA反應(yīng)條件：94℃預(yù)熱10min；94℃30s，52℃ 30s，72℃60s，30個循環(huán)；72℃延伸10min。反應(yīng)結(jié)束后，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物置4℃保存。

1.2.2.4 PCR反應(yīng)結(jié)果檢測 將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，于紫外凝膠電泳成像儀下觀察，出現(xiàn)與陽性對照分子相當(dāng)?shù)哪康臈l帶為陽性，并攝像保存。

1.2.3 藥敏試驗(yàn)

用紙片擴(kuò)散法（K-B法）進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，測定具有mecA基因的葡萄球菌對19種抗生素的敏感性。藥敏紙片為阿莫西林/克拉維酸（AMC）、氨芐西林/舒巴坦（AMS）、苯唑西林（OXA）、呋喃妥因（NIT）、紅霉素（CLA）、環(huán)丙沙星（NOR）、復(fù)方新諾明（SXT）、克林霉素（CLI）、奎奴普丁/達(dá)夫普?。≦-D）、利福平（RIF）、利奈唑胺（LNZ）、氯霉素（CAP）、青霉素（PEN）、慶大霉素（GEN）、四環(huán)素（TET）、頭孢唑林（CFZ）、萬古霉素（VAN）、亞胺培南（IMP）、左氧氟沙星（LVX），共計19種，為英國Oxoid公司生產(chǎn)。試驗(yàn)方法和結(jié)果判定按照臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化研究所（CLSI）《抗菌藥物敏感性試驗(yàn)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)》[1]規(guī)定執(zhí)行。

1.2.4 消毒劑抗力測定

1.2.4.1 菌懸液配制 將PCR試驗(yàn)檢出攜帶qacA基因的凝固酶陰性葡萄球菌與標(biāo)準(zhǔn)菌株金黃色葡萄球菌（ATCC6538）分離培養(yǎng)，取單個菌落接種于營養(yǎng)瓊脂斜面，37℃培養(yǎng)24h后，用胰蛋白胨磷酸鹽緩沖液（TPS）洗下，配制成菌懸液備用。

1.2.4.2 最小抑菌濃度（MIC）試驗(yàn)和最小殺菌濃度（MBC）試驗(yàn)

MIC試驗(yàn)[1]：采用肉湯稀釋法，將乙醇消毒劑用無菌蒸餾水做對倍系列稀釋，取各濃度乙醇消毒液2.5mL加入含2.5mL雙倍濃度營養(yǎng)肉湯中，然后加入0.1mL菌懸液，充分混勻，同時設(shè)定陽性與陰性對照。37℃48h培養(yǎng)后觀察結(jié)果。以無菌生長的最低稀釋度的濃度為MIC值。

MBC試驗(yàn)：是在MIC試驗(yàn)基礎(chǔ)上從各濃度無菌生長的試管中吸取0.5mL樣液加入到裝有4.5mL含中和劑肉湯（經(jīng)鑒定試驗(yàn)證明用5g/L硫代硫酸鈉、10g/L吐溫80、1g/L卵磷脂肉湯有效）的試管中混勻，放置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，觀察有細(xì)菌生長。以無菌生長的最低稀釋度的濃度為MBC值。

以上試驗(yàn)在水浴溫度20℃條件下進(jìn)行，均重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 基本情況

采集物體表面478份樣本、醫(yī)護(hù)人員手363份樣本。從中分離出63株CNS，其中有15株分離自物體表面、38株源于護(hù)士手、10株分離自醫(yī)生手。

2.2 分離鑒定及抗藥基因檢測結(jié)果

采集的841份醫(yī)院環(huán)境與醫(yī)務(wù)人員手樣本中分離出63株CNS，檢出率為7.49%。

檢測結(jié)果表明：在63株CNS中有12株攜帶qacA抗藥基因，攜帶率為19.05%。24株凝固酶陰性葡萄球菌（CNS）耐藥基因mecA檢出陽性，陽性率為38.09%。

圖1 12株凝固酶陰性葡萄球菌耐藥基因qacA PCR電泳圖

圖2 14株凝固酶陰性葡萄球菌耐藥基因mecA PCR電泳圖

圖3 10株凝固酶陰性葡萄球菌耐藥基因mecA PCR電泳圖

2.2 耐藥菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果

經(jīng)檢測：在醫(yī)院物體表面及醫(yī)護(hù)人員手上分離的63株CNS中，24株均為MRCNS，檢出率為38.09%，對抗生素藥物的藥敏試驗(yàn)結(jié)果見表1。

2.3 對乙醇消毒劑抗性結(jié)果

2.3.1最小抑菌濃度（MIC）檢測結(jié)果

經(jīng)測定結(jié)果表明，乙醇消毒劑對分離出的12株凝固酶陰性葡萄球菌的MIC值為1株高于標(biāo)準(zhǔn)菌株，1株低于標(biāo)準(zhǔn)菌株，10株與標(biāo)準(zhǔn)菌株相同（見表2）。

2.3.2 最小殺菌濃度（MBC）檢測結(jié)果

檢測結(jié)果表明，乙醇消毒劑對分離出的12株凝固酶陰性葡萄球菌的MBC值為1株高于標(biāo)準(zhǔn)菌株，1株低于標(biāo)準(zhǔn)菌株，10株與標(biāo)準(zhǔn)菌株相同（見表3）。

3 討論

近年來CNS在醫(yī)院的廣泛傳播，造成的院內(nèi)感染所帶來的醫(yī)療負(fù)擔(dān)已引起各國的重視。本文檢測結(jié)果顯示，在醫(yī)院環(huán)境物體表面及醫(yī)護(hù)人員手上分離出的凝固酶陰性葡萄球菌檢出率比較高為7.49%，其中檢出12株攜帶qacA抗藥基因的CNS中表皮葡萄球菌6株（50.0%）、溶血性葡萄球菌4株（33.3%）、瓦氏葡萄球菌和頭狀葡萄球菌各一株（8.3%）。結(jié)果表明，表皮葡萄球菌是CNS感染的主要菌種[2]。而隨著抗菌藥物的廣泛應(yīng)用，細(xì)菌耐藥率的逐年升高已成為臨床和微生物工作者關(guān)注和研究的重要課題[3]。不合理使用抗生素與抗生素耐藥性提高顯著有很大關(guān)系，尤其對某些常用抗生素更為突出。本研究檢出的63株CNS中24株均為MRCNS。因此，加強(qiáng)抗生素使用的宏觀管理，合理使用抗生素十分必要。

表1 24株MRCNS對19種抗生素藥物的耐藥率（%）

表2 乙醇消毒劑對攜帶qacA基因的CNS的MIC測定結(jié)果

表3 乙醇消毒劑對攜帶qacA基因的CNS的MBC測定結(jié)果

醫(yī)院內(nèi)受污染的物體表面及醫(yī)護(hù)人員的手等是造成耐藥細(xì)菌醫(yī)院感染的重要因素，其中醫(yī)護(hù)人員的手是導(dǎo)致患者間交叉感染、傳播耐藥細(xì)菌的重要途徑，對污染的環(huán)境及醫(yī)護(hù)人員手進(jìn)行有效的消毒是控制醫(yī)院感染的重要機(jī)制。本研究選用醇類消毒液，因醇類消毒劑是通過使細(xì)菌蛋白質(zhì)變性起殺菌作用，其作用快速，毒性低，所以目前多數(shù)快速手消毒液配方都是以醇類作為增效或主要?dú)⒕煞?。有研究顯示，消毒劑在公共環(huán)境的廣泛使用、過度使用以及不當(dāng)使用，可促使細(xì)菌產(chǎn)生耐消毒劑現(xiàn)象。同時具有抗生素與消毒劑抗性的菌株出現(xiàn)，則把醫(yī)院感染控制推向更加嚴(yán)峻的境地[4]。本研究結(jié)果顯示，12株攜帶qacA抗藥基因的CNS對乙醇的MIC及MBC抗性均為1株高于標(biāo)準(zhǔn)菌株，1株低于標(biāo)準(zhǔn)菌株，其余10株與標(biāo)準(zhǔn)菌株相同。已有研究表明醫(yī)院環(huán)境檢出的CNS對聚維酮碘、二氯異氰尿酸、三氯異氰尿酸[5]、醋酸氯己定[6]、苯扎溴銨[7]等消毒劑的抗力均有不同程度的增高。

研究醫(yī)院環(huán)境中物體表面和醫(yī)護(hù)人員手上分離的CNS耐藥性及對消毒劑的抗性，加強(qiáng)對醫(yī)院抗生素及化學(xué)消毒劑的嚴(yán)格管理和正確合理使用，是預(yù)防醫(yī)院感染的重要措施。而醫(yī)院環(huán)境內(nèi)物品和醫(yī)護(hù)人員手的消毒有不同的要求，消毒劑的消毒效果又受到各種因素影響。因此，必須根據(jù)消毒劑作用于細(xì)菌的可靠資料和有關(guān)新的研究成果，慎重選用最適宜濃度，以保證最佳的消毒效果，避免因消毒劑使用不當(dāng)而導(dǎo)致醫(yī)院感染暴發(fā)事件的發(fā)生。

[1]國家衛(wèi)生和計劃生育委員會.消毒技術(shù)規(guī)范，[S]，2002；85-86.

[2]姜緋，趙曉萌.凝固酶陰性葡萄球菌的菌種分布及流行變遷[J].實(shí)用醫(yī)技雜志，2006.13（9）.

[3]Scbwajber S，Stapjeton JT，Gijjigan PH.Emengncy ot Vancomycio resistance coagujose negtive staphylococci［J］.N Eng J Med，1987，316：927.

[4]David W，JohnP，Derrick C，waves of trouble：MRSA strain dynamics and assessment of the impact of infection control [J]. J Antimicrob Chemother.2011，66（2）：2685.

[5]林玲，李俐，孟琳等. 凝固酶陰性葡萄球菌抗藥基因檢測及其對消毒劑抗性研究[J].中國消毒學(xué)雜志，2011，28（5）：559.

[6]李俐，林玲，譚金煜等. 攜帶抗藥基因的CNS對醋酸氯己定的抗力研究[J].中國消毒學(xué)雜志，2012，29（8）：679.

[7]孟琳，李俐，尹世輝等. 凝固酶陰性葡萄球菌對苯扎溴銨消毒劑的抗力觀察[J].中國消毒學(xué)雜志，2012，29（7）：563.