孫 巍 談 智 徐 燕 吳曉松 王 嵬

江蘇省疾病預(yù)防控制中心，南京 210009

結(jié)核是世界上最古老、分布最廣泛的疾病之一，曾嚴(yán)重危害人類的健康。近年來(lái)由于人口流動(dòng)以及多發(fā)耐藥菌株增多等多種因素，結(jié)核病再次成為全球關(guān)注的重要公共衛(wèi)生問(wèn)題和社會(huì)問(wèn)題，WHO已將結(jié)核病作為重點(diǎn)控制的傳染病之一，并宣布全球結(jié)核病處于緊急狀態(tài)。我國(guó)是世界上22個(gè)結(jié)核病高發(fā)國(guó)家之一，居全球第二位，結(jié)核分枝桿菌感染導(dǎo)致的疾病一直嚴(yán)重威脅著人類的健康，仍然是我國(guó)重點(diǎn)防治的重大傳染性疾病[1～3]。

當(dāng)前結(jié)核病感染發(fā)病率高，病死率高、耐藥等原因?qū)е轮斡实?。殺滅自然環(huán)境中結(jié)核桿菌是控制結(jié)核病發(fā)生的重要環(huán)節(jié)。目前國(guó)內(nèi)外相繼出現(xiàn)了大量的結(jié)核分枝桿菌引起醫(yī)院內(nèi)感染的報(bào)道，而引起醫(yī)院內(nèi)感染增加的原因，除了生物因素、環(huán)境因素和營(yíng)養(yǎng)因素外，醫(yī)院消毒的不合理、不規(guī)范也是一個(gè)重要原因，消毒劑不合理使用，在殺滅細(xì)菌的同時(shí)，也誘導(dǎo)其產(chǎn)生對(duì)消毒劑的抗性，尤其是2003年SARS危機(jī)后，盲目使用消毒劑，不僅造成了消毒劑的浪費(fèi)，環(huán)境的污染，同時(shí)也造成了一些微生物對(duì)消毒劑抗性的產(chǎn)生，研究資料表明，醫(yī)院感染病原體的耐受現(xiàn)象已不僅僅局限于抗生素，開(kāi)始擴(kuò)展到了消毒劑。且隨著消毒劑的大量使用變得越來(lái)越廣泛，后果也越來(lái)越嚴(yán)重，尤其在醫(yī)院感染的傳播中，對(duì)消毒劑的耐受可能是重要因素之一[3～5]。

因此，本研究選擇醫(yī)院常用消毒劑碘伏為研究對(duì)象，觀察碘伏作用結(jié)核桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株以及從臨床病人中分離出來(lái)的耐多藥的菌株的殺滅效果，了解結(jié)核桿菌對(duì)常用消毒劑的抗性變化，并對(duì)6株細(xì)菌進(jìn)行耐消毒劑基因的分子生物學(xué)檢測(cè)。

材料與方法

試驗(yàn)材料

1. 試驗(yàn)菌株

結(jié)核桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株H37Rv（中國(guó)疾控中心國(guó)家結(jié)核病參比實(shí)驗(yàn)室），結(jié)核桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株H37Ra（中國(guó)疾控中心國(guó)家結(jié)核病參比實(shí)驗(yàn)室），結(jié)核桿菌臨床分離耐多藥菌株：耐多藥菌株a（利福平、異煙肼耐藥）；耐多藥菌株b（利福平、異煙肼、乙胺丁醇耐藥）；耐多藥菌株c（利福平、異煙肼、鏈霉素、乙胺丁醇耐藥）；耐多藥菌株d（利福平、異煙肼、鏈霉素、乙胺丁醇耐藥）（江蘇省疾病預(yù)防控制中心結(jié)核實(shí)驗(yàn)室提供）。

2. 消毒液

碘伏消毒液（聚乙烯吡咯烷酮碘，有效碘含量為5.4g/L）。

3. 試劑

5g/L硫代硫酸鈉、10g/L吐溫-80的TSB液，3%牛血清白蛋白，改良羅氏培養(yǎng)基等。

4. 器材

機(jī)械秒表（504型），恒溫恒濕培養(yǎng)箱（熱電-710L）等。

方法

1.菌懸液的制備

1）結(jié)核桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株H37Rv

在磨菌瓶中加入1～2滴10%吐溫-80水溶液，用無(wú)菌吸管尖端或火焰消毒的接種環(huán)刮取2～3周的新鮮菌落，至于磨菌瓶中；注意盡可能刮取斜面各個(gè)部位的菌落，避免挑取1～2個(gè)單獨(dú)菌落進(jìn)行試驗(yàn)，刮取菌落的量以半環(huán)或一環(huán)（5mg～10mg）為宜；旋緊瓶蓋，在渦旋振蕩器上振蕩10～30秒；靜置5分鐘，小心打開(kāi)瓶蓋，加入約2毫升滅菌生理鹽水，靜置片刻，使菌液中的大塊物質(zhì)沉淀；用無(wú)菌吸管吸取中上部的菌液，約1毫升，轉(zhuǎn)移到另一無(wú)菌試管中，與麥?zhǔn)媳葷峁鼙葷?；逐漸滴加滅菌生理鹽水，直至菌液濁度與標(biāo)準(zhǔn)麥?zhǔn)媳葷峁芤恢拢吹玫?mg/mL的菌液；上述操作需在Ⅱ級(jí)或Ⅱ級(jí)以上生物安全操作柜中進(jìn)行。

2） 結(jié)核桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株H37Ra

同1）步驟。

3）結(jié)核桿菌臨床分離耐多藥菌株

同1）步驟。

2. 中和劑選擇試驗(yàn)

參照消毒技術(shù)規(guī)范（2002版）[2]，設(shè)平行6組試驗(yàn)，按懸液定量殺菌試驗(yàn)程序進(jìn)行。

1）消毒液+菌懸液；

2）（消毒液+菌懸液）+中和劑；

3）中和劑+菌懸液；

4）（消毒液+中和劑）+菌懸液；

5）稀釋液+菌懸液（正常菌對(duì)照）；

6）稀釋液+中和劑+培養(yǎng)基作為陰性對(duì)照。

試驗(yàn)結(jié)果，以第1組不長(zhǎng)菌或僅有極少數(shù)菌落生長(zhǎng)；第2組有菌落生長(zhǎng)，較第1組為多，但較第3、4、5組為少；第3、4、5組組間菌落數(shù)在1×107CFU/mL ～ 5×107CFU/mL，誤差率不超過(guò)15%；第6組無(wú)菌生長(zhǎng)。表明所選中和劑及其濃度適宜。

3. 懸液定量殺菌實(shí)驗(yàn)

用無(wú)菌硬水配制試驗(yàn)濃度的碘伏消毒液（陽(yáng)性對(duì)照為稀釋液），取0.5mL菌懸液和0.5mL有機(jī)干擾物（3%牛血清白蛋白）在20℃±1℃水浴5min，再加入4.0mL消毒液，作用一定時(shí)間，取0.5mL混和液加入4.5mL中和劑，中和作用10min，取0.1mL加入改良羅氏平板培養(yǎng)基，用L棒涂抹均勻，培養(yǎng)1個(gè)月。試驗(yàn)重復(fù)3次。

4. 耐消毒劑基因的檢測(cè)

1）qacE△1-sulI基因檢測(cè)

引物P1：5’-T AGCGAGGGCTTT ACCT AAGC-3’，P2：ATTCAGAATGCCGAACACCG，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度300bp，引物由TAKARA寶生物工程（大連）有限公司合成。PCR反應(yīng)體系如下：

反應(yīng)：體積25uL，dNTPs的濃度各為200Lmol/L，引物濃度均為0.6Lmol/L，含TaqDNA聚合酶2U, 10倍的反應(yīng)緩沖液2.5uL，DNA模板為3uL。93℃預(yù)變性2min后，進(jìn)行35個(gè)循環(huán), 每次循環(huán)93℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸60s。35次循環(huán)結(jié)束后于72℃延伸5min。擴(kuò)增產(chǎn)物在1%的瓊脂糖凝膠中電泳30min，電壓110V，觀察結(jié)果。

2）qacA/B基因檢測(cè)

引物P1：5’- CT A TGGCAA T AGGAGA T A TGGTGT-3’，P2：5’- CCACT ACAGA TTCTTCAGCT ACA TG-3’，產(chǎn)物長(zhǎng)416bp。引物由TAKARA寶生物工程（大連）有限公司合成。

PCR反應(yīng)體系及電泳條件：同1）。

結(jié)果

中和劑鑒定試驗(yàn)

結(jié)果表明，含5g/L硫代硫酸鈉、10g/L吐溫-80的中和劑，可以有效中和含有效碘1000mg/L濃度的消毒液對(duì)龜分枝桿菌膿腫亞種的殘留作用，中和劑及其產(chǎn)物對(duì)試驗(yàn)菌生長(zhǎng)和培養(yǎng)基無(wú)不良影響，符合有效中和劑結(jié)果判定要求。含5g/L硫代硫酸鈉、5g/L吐溫-80的中和劑，可以有效中和含有效碘500mg/L濃度的消毒液對(duì)結(jié)核桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株H37Rv和H37Ra的殘留作用，中和劑及其產(chǎn)物對(duì)試驗(yàn)菌生長(zhǎng)和培養(yǎng)基無(wú)不良影響，符合有效中和劑結(jié)果判定要求（見(jiàn)表1）。

對(duì)結(jié)核桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株H37Rv的殺滅效果

研究結(jié)果表明，含有效碘125mg/L的消毒液作用7min，有效碘250mg/L的消毒液作用3min，有效碘500mg/L的消毒液作用1min對(duì)結(jié)核桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株H37Rv殺滅對(duì)數(shù)值＞4.00。且隨著有效濃度增加、作用時(shí)間延長(zhǎng)，殺滅效果逐漸遞增（見(jiàn)表2）。

對(duì)結(jié)核桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株H37Ra的殺滅效果

研究結(jié)果表明，含有效碘250mg/L的消毒液作用5min，有效碘500mg/L的消毒液作用1min，對(duì)結(jié)核桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株H37Ra殺滅對(duì)數(shù)值＞4.00。且隨著有效濃度增加、作用時(shí)間延長(zhǎng)，殺滅效果逐漸遞增（見(jiàn)表3）。

對(duì)多株臨床分離的多株耐多藥菌株的殺滅效果

1. 耐多藥菌株a（利福平、異煙肼耐藥）；

研究結(jié)果表明，含有效碘125mg/L的消毒液作用5min 、250mg/L的消毒液作用1min 、500mg/L的消毒液作用1min，對(duì)耐多藥株a殺滅對(duì)數(shù)值＞4.00。且隨著有效濃度增加、作用時(shí)間延長(zhǎng)，殺滅效果逐漸遞增（見(jiàn)表4）。

表1 中和劑鑒定試驗(yàn)結(jié)果

表2 對(duì)結(jié)核桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株H37Rv殺滅效果

表3 對(duì)結(jié)核桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株H37Ra殺滅效果

2. 耐多藥菌株b（利福平、異煙肼、乙胺丁醇耐藥）

研究結(jié)果表明，含250mg/L的消毒液作用1min，對(duì)耐多藥株b殺滅對(duì)數(shù)值＞4.00。且隨著有效濃度增加，殺滅效果逐漸遞增，作用時(shí)間的影響相對(duì)較小（見(jiàn)表5）。

3. 耐多藥菌株c（利福平、異煙肼、鏈霉素、乙胺丁醇耐藥）；

研究結(jié)果表明，含有效碘125mg/L的消毒液作用5min 、250mg/L的消毒液作用3min 、500mg/L的消毒液作用1min，對(duì)耐多藥菌株c殺滅對(duì)數(shù)值＞4.00。且隨著有效濃度增加、作用時(shí)間延長(zhǎng)，殺滅效果逐漸遞增（見(jiàn)表6）。

4.耐多藥菌株d（利福平、異煙肼、鏈霉素、乙胺丁醇耐藥）

研究結(jié)果表明，含有效碘125mg/L的消毒

液作用5min 、250mg/L的消毒液作用3min 、500mg/L的消毒液作用1min，對(duì)耐多藥菌株d殺滅對(duì)數(shù)值＞4.00。且隨著有效濃度增加、作用時(shí)間延長(zhǎng)，殺滅效果逐漸遞增（見(jiàn)表7）。

表4 對(duì)耐多藥菌株a殺滅效果

表5 對(duì)耐多藥菌株b殺滅效果

表6 對(duì)耐多藥菌株c殺滅效果

耐消毒劑基因的檢測(cè)

1. 經(jīng)PCR檢測(cè)證明，2株標(biāo)準(zhǔn)菌株和4株臨床分離的耐多藥菌株的qacE△1-sulI基因的PCR檢測(cè)，標(biāo)準(zhǔn)菌株H37Rv、耐多藥菌株a、耐多藥菌株b為陽(yáng)性，陽(yáng)性率50%（見(jiàn)圖1）。

2. 經(jīng)PCR檢測(cè)證明， 2株標(biāo)準(zhǔn)菌株和4株臨床分離的耐多藥菌株的qacA/B基因PCR檢測(cè)皆為陰性，均未檢測(cè)到抗消毒劑基因。

討論

目前，用于結(jié)核病治療的一線藥物主要有：利福平、異煙肼、鏈霉素、乙胺丁醇等，其中，利福平和異煙肼是應(yīng)用于臨床的主要藥物，至少對(duì)這兩種藥物耐藥，評(píng)判該臨床菌株為耐多藥菌株，因此，本研究選取結(jié)核桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株H37Rv、結(jié)核桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株H37Ra、以及4株耐多藥菌株為代表。而碘伏廣泛應(yīng)用于臨床消毒，屬于廣譜、中效消毒劑，其殺菌作用較強(qiáng)，作用速度快，且對(duì)皮膚黏膜刺激較小[6]。

圖1 qacE△1-sulI基因PCR電泳圖

表7 對(duì)耐多藥菌株d殺滅效果

本研究結(jié)果表明，含有效碘250mg/L作用5min、500mg/L作用1min，對(duì)結(jié)核桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株H37Rv殺滅對(duì)數(shù)值＞4.00，含有效碘500mg/L作用1min，對(duì)結(jié)核桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株H37Ra殺滅對(duì)數(shù)值＞4.00，含有效碘250mg/L作用3min，對(duì)4株耐多藥菌株殺滅對(duì)數(shù)值均＞4.00。可見(jiàn)，碘伏消毒液對(duì)結(jié)核桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株以及耐多藥菌均有良好的殺菌作用，可以提倡應(yīng)用于醫(yī)院及高危環(huán)境中醫(yī)護(hù)人員或病人及家屬的皮膚表面的消毒，可減少交叉感染，降低及醫(yī)院感染的發(fā)生，有效控制結(jié)核病的傳播和流行。

經(jīng)PCR檢測(cè)證明，2株標(biāo)準(zhǔn)菌株和4株臨床分離的耐多藥菌株的qacE△1-sulI基因的PCR檢測(cè)，標(biāo)準(zhǔn)菌株H37Rv、耐多藥菌株a、耐多藥菌株b為陽(yáng)性，陽(yáng)性率50%。耐消毒基因qacA/B基因的PCR檢測(cè)皆為陰性，均未檢測(cè)到該抗消毒劑基因。

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