高 森，李正翔，趙 鵬，王兵濤，房志仲，張彥文#(.天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院，天津 30005;.天津醫(yī)科大學(xué)，天津 300070)

中藥是我國(guó)傳統(tǒng)中醫(yī)中防病治病的載體，在中華民族五千余年的歷史中寫下了濃墨重彩的一筆［1］。地黃是中藥中一味重要藥材，傳統(tǒng)中醫(yī)認(rèn)為，熟地黃味甘，性微溫，具有滋陰補(bǔ)血，益精填髓之功效，具有廣泛的用途，因此，地黃的內(nèi)在質(zhì)量直接關(guān)系到其療效和應(yīng)用安全［2］。中藥是一種含有多種成分和化學(xué)物的復(fù)雜體系，指紋圖譜廣泛應(yīng)用于其成分和產(chǎn)地分析以及藥物的質(zhì)量控制［3］。指紋圖譜研究有多種方法，其中高效液相色譜(HPLC)指紋圖譜技術(shù)具有高分離效能，是使用最為廣泛的一種。因此，本研究采用HPLC指紋圖譜對(duì)熟地黃質(zhì)量穩(wěn)定性進(jìn)行研究，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 儀器

LC-10A HPLC儀(日本島津公司生產(chǎn));戴安Pad檢測(cè)儀;依利特Betasil色譜柱。

1.2 藥品與試劑

選用清蒸和酒燉2種炮制方法加工的熟地黃各10批，地黃均來(lái)自同一生產(chǎn)基地的同一批次;乙腈和甲醇為色譜純(購(gòu)自天津市四有精細(xì)化學(xué)品有限公司);正丁醇，醋酸等。

2 方法

2.1 供試品溶液的制備

取粉末狀熟地黃樣品2 g，放入錐形瓶中(100 ml)，加入50 ml飽和水正丁醇溶液，蓋緊塞子，放置過(guò)夜。用250 W、50 kHz的超聲波處理并過(guò)濾，去除初濾液，量取30 ml并蒸干。所得殘?jiān)尤苡诩状既芤褐胁⒁浦寥萘科?50 ml)中，加至刻度。搖勻后過(guò)濾即得到樣品。

2.2 色譜條件

流動(dòng)相:乙腈-0.1%醋酸;柱溫:25℃;流速:1 ml/min;進(jìn)樣量:5 μl，檢測(cè)波長(zhǎng):300 nm;梯度洗脫。按照《中華人民共和國(guó)藥典:一部》(2005年版)［4］中 HPLC試驗(yàn)進(jìn)行，精密吸取供試品溶液5 μl，加入HPLC儀中測(cè)定。

2.3 試驗(yàn)質(zhì)量控制

2.3.1 穩(wěn)定性試驗(yàn):取同一份供試品溶液，于 0、2、4、6、8、10、12、24 h分別測(cè)定1次。結(jié)果表明各個(gè)色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD為1.6%(RSD≤3%)，供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.2 精密度試驗(yàn):同一樣品連續(xù)進(jìn)樣8次，結(jié)果表明各色譜峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD為2.6%(RSD≤3%)，試驗(yàn)精密度良好。

2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn):取樣品8份，按照上述試驗(yàn)方法處理并分別檢驗(yàn)，結(jié)果顯示各色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD為1.5%(RSD≤3%)，試驗(yàn)精密度良好。

2.4 HPLC指紋圖譜的建立

2.4.1 熟地黃色譜圖測(cè)定:取各供試品溶液，嚴(yán)格按照上述試驗(yàn)方法進(jìn)行，記錄所得色譜圖，各色譜圖的疊加圖見圖1、2。

2.4.2 共有模式圖譜相似度分析:按以下要求建立指紋圖譜:整體觀察HPLC圖譜峰，記錄能夠構(gòu)成指紋圖譜的色譜峰并記錄相對(duì)應(yīng)的峰號(hào)、峰數(shù)和峰位。比較所得到的所有批次的HPLC色譜圖后，確定2種炮制方法的組成峰特征。清蒸熟地黃的共有峰有12個(gè)，酒燉熟地黃的共有峰有13個(gè)，這些共有峰構(gòu)成了2種熟地黃的HPLC色譜指紋圖譜。共有模式圖譜的相似度使用相似度評(píng)價(jià)軟件進(jìn)行分析，結(jié)果見表1、2;各樣品共有模式圖見圖3、4;10批清蒸熟地黃相似度的散點(diǎn)圖見圖5;10批酒燉熟地黃相似度的散點(diǎn)圖見圖6。

圖1 清蒸熟地黃的色譜圖疊加圖Fig 1 Stacking chart of the fingerprints of the Prepared Rehmannia Root that processed in steam

圖2 酒燉熟地黃的色譜圖疊加圖Fig 2 Stacking chart of the fingerprints of the Prepared Rehmannia Root that processed in wine stew

表1 清蒸熟地黃共有模式圖譜相似度Tab 1 Resemblance of the mutual mode of HPLC fingerprints of the Prepared Rehmannia Root that processed in steam

表2 酒燉熟地黃共有模式圖譜相似度Tab 2 Resemblance of the mutual mode of HPLC fingerprints of the Prepared Rehmannia Root that processed in wine stew

圖3 清蒸熟地黃樣品的共有模式圖譜Fig 3 Mutual mode of HPLC fingerprints of the Prepared Rehmannia Root that processed in steam

圖4 酒燉熟地黃樣品的共有模式圖譜Fig 4 mutual mode of HPLC fingerprints of the Prepared Rehmannia Root that processed in wine stew

圖5 清蒸熟地黃相似度散點(diǎn)圖Fig 5 Scatterplot of resemblance of the Prepared Rehmannia Root that processed in steam

圖6 酒燉熟地黃相似度散點(diǎn)圖Fig 6 Scatterplot of resemblance of the Prepared Rehmannia Root that processed in wine stew

3 結(jié)果

在觀察實(shí)驗(yàn)所得的清蒸和酒燉熟地黃樣品的各色譜圖后發(fā)現(xiàn)，清蒸熟地黃樣品的共有峰有12個(gè)，酒燉熟地黃樣品的共有峰有13個(gè)，這些共有峰即為2種樣品的特征組成峰，構(gòu)成了清蒸熟地黃和酒燉熟地黃的HPLC指紋圖譜的特征峰。

由表1、2可見，10批清蒸熟地黃指紋圖譜相似度分別為0.979、0.988、0.982、0.983、0.944、0.900、0.847、0.859、0.989和0.822，只有7號(hào)，8號(hào)和10號(hào)樣品的相似度低于0.9，說(shuō)明清蒸熟地黃成分的一致性較好。10批酒燉熟地黃的相似度分別為 0.942、0.966、0.947、0.831、0.911、0.912、0933、0.988、0.945和0.984，只有4號(hào)樣品的相似度低于0.9，說(shuō)明酒燉熟地黃成分的一致性尚優(yōu)于清蒸熟地黃，一致性較好。酒燉熟地黃樣品的指紋圖譜顯示，在43～76 min內(nèi)峰的相對(duì)比例較為穩(wěn)定，體現(xiàn)了酒燉熟地黃的特征。由圖5、6可見，清蒸熟地黃和酒燉熟地黃的相似度有較大區(qū)別。

由于熟地黃復(fù)雜的化學(xué)構(gòu)成，使用其他方法指紋圖譜難以建立。本研究中，運(yùn)用HPLC指紋圖譜法成功建立了樣品的指紋圖譜和指紋圖譜的共有模式圖譜，并且對(duì)2種樣品的HPLC指紋圖譜相似度進(jìn)行了分析，最后得到以下結(jié)果:2種炮制方法不同的樣品與各自的共有圖譜相似度較高，說(shuō)明產(chǎn)品質(zhì)量較好。

4 討論

由于中藥的特殊性，其化學(xué)構(gòu)成受多因素影響，比如生長(zhǎng)環(huán)境、種植方式、氣候條件、儲(chǔ)藏方式、加工手段等。在這些因素的共同作用下造就了中藥化學(xué)組成復(fù)雜的現(xiàn)狀，指紋圖譜法是一種利用現(xiàn)代技術(shù)分析復(fù)雜成分體系特征的技術(shù)［5］。

本研究采用HPLC指紋圖譜法對(duì)熟地黃質(zhì)量穩(wěn)定性進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示清蒸熟地黃樣品的共有峰有12個(gè)，酒燉熟地黃樣品的共有峰有13個(gè)，這些共有峰構(gòu)成了清蒸熟地黃和酒燉熟地黃的HPLC指紋圖譜的特征峰。10批清蒸熟地黃指紋圖譜相似度除了7號(hào)、8號(hào)和10號(hào)樣品外均高于0.9，說(shuō)明清蒸熟地黃成分的一致性較好。10批酒燉熟地黃指紋圖譜相似度只有4號(hào)樣品的相似度低于0.9，且在43～76 min內(nèi)峰的相對(duì)比例較為穩(wěn)定，體現(xiàn)了酒燉熟地黃的特征。由圖5、6可見，清蒸熟地黃和酒燉熟地黃的相似度有較大區(qū)別，這是由于不同加工方式所致。由于藥材易受生長(zhǎng)環(huán)境等因素的影響，即使采用同一批次的藥材，其內(nèi)部化學(xué)組成也具有一定的差異。這在本研究RSD計(jì)算中得以體現(xiàn)，本研究中所得RSD均＜3%，差異影響不大。

以上研究表明，HPLC指紋圖譜技術(shù)是研究熟地黃質(zhì)量穩(wěn)定性的有效手段。

［1］張禮菊.色譜指紋圖譜在中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)體系中的應(yīng)用［J］.安徽醫(yī)藥，2009，13(11):1414-1417.

［2］白雁，雷敬衛(wèi).液相色譜指紋圖譜在熟地黃質(zhì)量穩(wěn)定性中的應(yīng)用研究［J］.河南師范大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2008，36(5):89-92.

［3］胡燕，王文波，宋力飛，等.紅花 HPLC指紋圖譜研究［J］.湖南中醫(yī)雜志，2013，29(3):110-112.

［4］國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典:一部［S］.北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2005:141.

［5］曹建軍，梁宗鎖，楊東風(fēng)，等.應(yīng)用HPLC指紋圖譜技術(shù)確定熟地黃炮制終點(diǎn)［J］.中國(guó)中藥雜志，2010，35(19):2556-2560.