石敏 ，黃建中 ，蔣琴素 ，郭得平 ，張敬澤 ，陳子元

（1.浙江大學(xué)原子核農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，杭州，310029；2.浙江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院；3.浙江大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院）

茭白黑粉菌（Ustilago esculentaP.Henn.）侵染茭白莖頂端組織并在其中大量繁殖后誘導(dǎo)形成茭白的食用器官肉質(zhì)莖[1～4]。研究表明，茭白黑粉菌的適宜生長溫度為15～30℃，32℃時生長受到嚴重抑制，在液體培養(yǎng)條件下幾乎不生長[5，6]。天然茭白黑粉菌對較高溫的敏感性通常被認為是平原茭白在夏季高溫時期（7～8月）不能孕茭的主要原因[7～8]。7～8月正值蔬菜秋淡季節(jié)，因此，選育高溫型茭白新品種在生產(chǎn)上具有重要的應(yīng)用價值。本試驗通過對茭白黑粉菌進行輻照誘變，篩選出耐高溫的突變體，并對其生長特征作初步分析。

1 材料與方法

1.1 菌株及其培養(yǎng)

從正常膨大茭白（浙茭2號）肉質(zhì)莖單孢分離茭白黑粉菌菌株（M-T菌株[1]），灰茭黑粉菌菌株（T菌株）直接由其冬孢子萌發(fā)，采用土豆-葡萄糖-瓊脂（PDA）固體培養(yǎng)基在生長箱中28℃培養(yǎng)。固體培養(yǎng)用于黑粉菌的輻照、耐熱篩選和短期保存，耐熱菌株保存于40℃生長箱中。

1.2 輻照

茭白黑粉菌菌落在PDA培養(yǎng)基上直徑達到20～25 mm時對其進行5，10 kGy兩個劑量水平的60Co-γ 射線輻照[9]。

1.3 耐熱突變體的篩選

取輻照后的菌落以劃線涂布法轉(zhuǎn)接到PDA培養(yǎng)基上，在恒溫培養(yǎng)箱中40℃下培養(yǎng)，篩選出耐熱突變體株系（H-T菌株）。

1.4 生長測量

生長特征試驗采用液體培養(yǎng)法，將菌株接種到100 mL土豆-蔗糖培養(yǎng)液（PSB，土豆 200 g，蔗糖20 g，水1 000 mL）中，含菌培養(yǎng)液起始OD600nm約為0.05，在不同溫度下，130 r/min條件下?lián)u瓶（250 mL）培養(yǎng)，穩(wěn)定期OD600nm可達2.5。

1.5 數(shù)據(jù)處理

所測指標在不同樣品間至少重復(fù)3次，結(jié)果以平均值±標準差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 耐熱突變體篩選

來自灰茭的T菌株輻照處理后40℃培養(yǎng)過程中全部死亡，未獲得耐熱突變體。而來自正常膨大茭白的M-T菌株經(jīng)輻照后，于40℃下培養(yǎng)，在菌落表面形成一些小的突起，這些新生小菌落經(jīng)過不斷劃線涂布轉(zhuǎn)接到PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)，5 kGy和10 kGy輻照誘變后各獲得10個耐熱菌株（H-T菌株），其生長特征如表1所示，培養(yǎng)至對數(shù)生長期中期的時間長短可以反映出菌株生長速率的快慢（圖1）。耐熱突變體中，5K7和5K8菌株分別是生長速率最快和最慢的耐熱菌株，培養(yǎng)至對數(shù)生長期中期的時間分別需要17 h和28.2 h（表1）。來自正常膨大茭白的M-T菌株、灰茭冬孢子萌發(fā)形成的T菌株以及部分5 kGy輻照誘變獲得的耐熱突變體在土豆-蔗糖培養(yǎng)液（PSB）中的生長曲線如圖1所示，可見，H-T菌株生長速率要比M-T和T菌株快。

2.2 溫度對茭白黑粉菌生長的影響

在液體培養(yǎng)條件下，茭白黑粉菌M-T和T菌株的適宜生長溫度范圍為15～28℃，最適生長溫度28℃，32℃下幾乎不再生長（表2）。在15～40℃范圍內(nèi)，隨溫度升高，耐熱黑粉菌的生長速率加快；溫度下降，則菌株生長的延滯期延長。3種菌株延滯期顯著延長的臨界溫度并不相同，以培養(yǎng)至對數(shù)期中期的時間作比較，延長為28℃時1.8倍以上的溫度分別為 15℃（M-T 菌株）、20℃（T 菌株）和 20℃（HT菌株）。耐熱突變體在28～40℃范圍內(nèi)，培養(yǎng)至對數(shù)期中期的時間變幅僅20%（表2）。

表1 茭白耐熱突變體培養(yǎng)至對數(shù)期中期所需時間

圖1 茭白黑粉菌M-T菌株、T菌株及部分耐熱突變體的生長變化（28℃，130 r/min）

在20～28℃溫度范圍內(nèi)，液體培養(yǎng)的T菌株到達對數(shù)期中期需要36～66 h，M-T菌株需要59～80 h，H-T菌株僅需要17～51 h（表2）。28℃下培養(yǎng)72 h后這3種菌株的生長均已進入穩(wěn)定期，40℃下只有耐熱突變體進入穩(wěn)定期生長，而M-T和T菌株培養(yǎng)液的OD600nm與接種起始值相近（圖2），表明不再生長。

3 小結(jié)與討論

根據(jù)來源、形態(tài)和生長特征的不同可以將天然茭白黑粉菌分成2種截然不同的菌株：來自正常膨大肉質(zhì)莖的“菌絲-冬孢子”型（mycelia-teliospore，M-T）和來自灰茭的“冬孢子”型（teliospore，T）[1～10]。T菌株在肉質(zhì)莖膨大初始階段就開始形成冬孢子堆，潛育期較短[11]。本研究結(jié)果表明，T菌株和M-T菌株均不能在32℃以上繁殖，這與前人報道[5，6]一致。在20～28℃范圍內(nèi)，土豆培養(yǎng)基中T菌株的繁殖速率顯著快于M-T菌株，而耐熱突變體（H-T菌株）的繁殖速率比T菌株更快。從3種菌株延滯期顯著延長的臨界溫度高低分析，H-T菌株和T菌株較高，而M-T菌株較低。因此，H-T菌株在生長特征上與M-T菌株存在較大差異，茭白黑粉菌耐熱突變體可否用于選育高溫型茭白品種尚不明確。

表2 溫度對茭白黑粉菌3種菌株生長的影響

圖2 熱處理（40℃，72 h）對菰黑粉菌3種菌株生長的影響

盡管T-菌株與M-T菌株類似，對電離輻射也具有極高的抗性[9]，但無論是否經(jīng)過輻照，均未能從T菌株中分離到耐熱菌株，而可以從M-T菌株中分離獲得耐熱突變體。T-菌株與M-T菌株在抗電離輻射和耐高溫方面所表現(xiàn)出的異同性，其分子機理值得進一步探索。

[1]Yang H C,Leu L S.Formation and histopathology of galls induced byUstilago esculentainZizania latifolia[J].Phytopath,1978,68:1 572-1 576.

[2]Chan Y-S,Thrower L B.The host-parasite relationship betweenZizania caducifloraTurcz.andUstilago esculentaP.Henn.I.structure and development of the host and hostparasite combination[J].New Phytol，1980，85：201-207.

[3]劉偉，黃建中，郭得平，等.茭白肉質(zhì)莖膨大期間的氧化脅迫[J].核農(nóng)學(xué)報，2011，25（4）：824-827.

[4]Zhang J Z,Chu F Q,Guo D P,et al.Cytology and ultrastructure of interactions betweenUstilago esculentaandZizania latifolia[J].Mycological Progress,2012,11:499-508.

[5]郭得平，李曙軒，曹小芝.茭白黑粉菌某些生物學(xué)特征的研究[J].浙江農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，1991，17（1）：80-84.

[6]Chung K R,Tzeng D D.Nutritional requirements of the edible gall-producing fungusUstilago esculenta[J].J Biol Sci,2004,4:246-252.

[7]柯衛(wèi)東，孔慶東，周國林.菰黑粉菌不同菌株比較研究[J].長江蔬菜，1995（8）：21-24.

[8]鄧建平，石敏，黃建中，等.不同海拔高度對茭白生長及孕茭的影響[J].中國蔬菜，2013（12）：88-93.

[9]黃建中，石敏，郭得平，等.菰黑粉菌對60Co-γ輻射的抗性研究[J].長江蔬菜，2011（16）：72-74.

[10]You W,Liu Q,Zou K,et al.Morphological and molecular differences in two strains of Ustilago esculenta[J].Curr Microbiol,2011,62:44-54.

[11]丁小余，徐祥生，陳維培.“雄茭”、灰茭形成規(guī)律的初步研究[J].武漢植物學(xué)研究，1991，9（2）：115-120.