倪連松，顧玲佳，高 倩

（1.溫州醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院內(nèi)分泌科，浙江 溫州 325000；2.臺州市第一人民醫(yī)院內(nèi)分泌科，浙江 臺州318020；3.紹興市第六人民醫(yī)院內(nèi)分科，浙江 紹興 312000）

糖尿病性腎病（diabetic nephropathy，DN）是糖尿病常見的并發(fā)癥之一，也是引起糖尿病患者死亡的主要原因之一。DN的發(fā)病機(jī)制目前尚未完全闡明。越來越多的研究表明，與糖尿病性腎小球病變相比，腎小管間質(zhì)病變的嚴(yán)重程度與蛋白尿排泄量和腎功能的進(jìn)行性下降有著更為緊密的聯(lián)系［1－2］。研究表明，腎間質(zhì)纖維化在DN的發(fā)生發(fā)展中占有重要地位，而腎小管上皮細(xì)胞－肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化（epithelial－myofibroblast transdifferentiation，EMT）是腎間質(zhì)纖維化的重要機(jī)制［3］。

近年來，隨著對Rho A／Rho相關(guān)卷曲螺旋形成蛋白絲氨酸／蘇氨酸激酶（Rho A／Rho－associated coiledcoil for ming protein serine／threonine kinase，Rho A／ROCK）信號通路研究的加深，該信號通路在EMT中的作用引起了人們的高度重視［4－5］。Rho A是Ras超家族中小分子G蛋白的成員之一，在GTP結(jié)合激活態(tài)和與GDP結(jié)合失活態(tài)之間相互轉(zhuǎn)換，發(fā)揮其生理功能。ROCK，又稱Rho激酶，是Rho A下游的主要效應(yīng)因子。腎中Rho A／ROCK信號通路具有重要的功能，介導(dǎo)了腎小管細(xì)胞、系膜細(xì)胞和足細(xì)胞的細(xì)胞支架的重構(gòu)；促成了上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)分化，因而在腎纖維化中起著重要的作用［6］。

目前已發(fā)現(xiàn)的ROCK抑制劑有十余種，其中以法舒地爾（fasudil）和Y27632的使用最廣泛，可以擴(kuò)張血管，降低內(nèi)皮細(xì)胞的張力，改善腦組織微循環(huán)，同時可拮抗炎性因子、保護(hù)神經(jīng)、抗細(xì)胞凋亡并促進(jìn)神經(jīng)再生等［7］。法舒地爾是唯一用于臨床的ROCK選擇性抑制劑，目前主要用于多種原因引起的缺血性腦血管疾病的防治。法舒地爾對DN的治療作用已經(jīng)在多種糖尿病動物模型中得到證實，可以減少尿蛋白，減少腎小球系膜外基質(zhì)堆積，減輕腎小球硬化和腎間質(zhì)纖維化等［8－11］。但是有關(guān)法舒地爾對高糖誘導(dǎo)的腎小管EMT影響的研究還鮮見報道。

為進(jìn)一步探究法舒地爾對DN的治療作用機(jī)制，本研究以高糖培養(yǎng)HK－2細(xì)胞觀察高糖培養(yǎng)所誘導(dǎo)的EMT現(xiàn)象，并用不同濃度法舒地爾進(jìn)行干預(yù)，探討法舒地爾對高糖培養(yǎng)腎小管EMT的影響，同時檢測其對結(jié)締組織生長因子（connective tissue growth factor，CTGF）的影響，初步探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、試劑和儀器

HK－2細(xì)胞購自武漢大學(xué)中國典型培養(yǎng)物保藏中心，編號：GDC152。鹽酸法舒地爾注射液購自天津紅日藥業(yè)股份有限公司（產(chǎn)品批號：091114）；DMEM培養(yǎng)液和胎牛血清購自美國Gibco公司；鼠抗人E－鈣黏素、波形蛋白、CTGF、α－平滑肌肌動蛋白（α－smooth muscle actin，α－SMA）、ROCK 抗體及羊抗人磷酸化－肌球蛋白磷酸酶目標(biāo)亞單位1－蘇氨酸696（p－MYPT1－Thr696）購自美國 Santa Cruz公司；兔抗人p－MYPT1－Thr853購自美國Cell Signaling公司；FITC標(biāo)記羊抗大鼠Ig G抗體購于聯(lián)科生物公司；免疫共沉淀試劑盒、辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗購自江蘇省碧云天生物技術(shù)研究所。酶標(biāo)儀：美國Ther mo公司；Imaglab凝膠成像系統(tǒng)：美國Bio－Rad公司。

1.2 HK－2細(xì)胞培養(yǎng)和分組

HK－2細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)在含10%胎牛血清、青霉素100 k U·L－1和鏈霉素100 k U·L－1的低糖（5.5 mmol·L－1D－葡萄糖）DMEM 培養(yǎng)液中，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2～3 d換液1次。為了誘導(dǎo)EMT，HK－2細(xì)胞在高糖（60 mmol·L－1）條件下培養(yǎng)72 h，該葡萄糖濃度選擇參考預(yù)實驗結(jié)果，時間選擇參考文獻(xiàn)［12－13］。

將HK－2細(xì)胞分為6組：正常對照組（葡萄糖5.5 mmol·L－1），高張組（葡萄糖5.5 mmol·L－1＋甘露醇54.5 mmol·L－1），高糖組（葡萄糖60 mmol·L－1），高糖＋法舒地爾5，10和20μmol·L－1組。

1.3 免疫共沉淀法檢測HK－2細(xì)胞ROCK活性

HK－2細(xì)胞接種在10 c m細(xì)胞培養(yǎng)皿中，細(xì)胞培養(yǎng)貼壁生長至100%融合，更換為無血清培養(yǎng)液同步培養(yǎng)24 h，用含葡萄糖60 mmol·L－1的高糖培養(yǎng)液干預(yù)，分別于0，30 min和1，3，7，12和24 h收集細(xì) 胞［12］，裂解細(xì)胞后，收集裂解液于4℃，17 949×g離心30 min，收集上清，取50μl上清用于檢測總ROCK的表達(dá)并作為內(nèi)參照，余上清加入10μl p－MYPT1－Thr696或10μl p－MYPT1－Thr853一抗，4℃搖床過夜，再加入充分混勻的蛋白A＋G瓊脂糖4℃搖床2 h以沉淀免疫復(fù)合物，用預(yù)冷的PBS洗滌沉淀3次，完成最后一次洗滌后，去除上清，加入1×SDS－PAGE電泳上樣緩沖液。變性后取50μl進(jìn)行10%SDS－PAGE電泳，Western蛋白質(zhì) 印 跡 法 檢 測 p－MYPT1－Thr696 和 p－MYPT1－Thr853的表達(dá)，用I magelab軟件分析結(jié)果，以所測得的各條帶的積分吸光度（integrated absor bance，IA）與相應(yīng)總ROCK的IA的比值表示ROCK活性。

1.4 免疫熒光細(xì)胞化學(xué)法檢測α－SMA的表達(dá)

HK－2細(xì)胞以每孔5×104細(xì)胞接種在置有爬片的24孔板內(nèi)，細(xì)胞培養(yǎng)貼壁生長至70%融合后，更換為無血清培養(yǎng)液同步培養(yǎng)24 h，按實驗分組換為不同培養(yǎng)液（1 ml），于72 h收集細(xì)胞爬片，4%多聚甲醛溶液固定和0.1%Triton X－100溶液穿孔細(xì)胞后用10%正常羊血清37℃封閉1 h，滴加一抗（1∶100大鼠抗人α－SMA 抗體），4℃孵育過夜，次日清洗后滴加FITC標(biāo)記的二抗（1∶200羊抗大鼠Ig G抗體）避光37℃孵育30 min，用碘化丙啶溶液染色30 min，清洗后用抗熒光淬滅封片劑封片，立即用激光共聚焦顯微鏡觀察并拍片，F(xiàn)ITC經(jīng)490 n m波長激發(fā)光激發(fā)后顯示綠色熒光，PI經(jīng)530 n m波長的激發(fā)光激發(fā)后顯示紅色。

1.5 Wester n蛋白質(zhì)印跡法檢測HK－2細(xì)胞E－鈣黏素、波形蛋白和CTGF的表達(dá)

HK－2細(xì)胞接種于10 c m細(xì)胞培養(yǎng)皿中，細(xì)胞培養(yǎng)貼壁生長至70%融合后，更換為無血清培養(yǎng)液同步培養(yǎng)24 h，按實驗分組換為不同的培養(yǎng)液。72 h后終止培養(yǎng)，裂解細(xì)胞后，收集裂解液于4℃，17 949×g離心30 min，取上清用BCA蛋白濃度測定法測定蛋白質(zhì)濃度，操作按說明書進(jìn)行。用5×上樣緩沖液變性蛋白，取總蛋白60μg上樣，用10%SDS－PAGE凝膠進(jìn)行電泳后，將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜。用含5%脫脂牛奶的TBST室溫?fù)u床封閉2 h，分別加入一抗即小鼠抗人E－鈣黏素（1∶200），波形蛋白（1∶200），CTGF（1∶200）和β肌動蛋白（1∶2000），4℃孵育過夜。TBST洗膜后分別加入相應(yīng)的辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗（1∶1000），室溫?fù)u床孵育1 h，TBST洗膜后分別取等量ECL試劑盒溶液A和B液，混合后加于PVDF膜，避光反應(yīng) 1 min，Bio－Rad 公 司 Molecular Imager Chemi DocTMXRS成像系統(tǒng)自動曝光掃描并用I magelab軟件對條帶進(jìn)行分析，以所測得的各條帶的IA與內(nèi)參照β肌動蛋白的IA的比值表示目的蛋白的相對表達(dá)水平。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 高糖對HK－2細(xì)胞ROCK活性的影響

圖1結(jié)果顯示，與未加高糖刺激前（0 min）比較，高糖60 mmol·L－1培養(yǎng)3 ～24 h后 HK－2細(xì)胞p－MYPT1－Thr696和p－MYPT 1－Thr 8 5 3蛋白表達(dá)明顯增加（P＜0.01），即ROCK活性明顯升高，提示在一定時間范圍內(nèi)，高糖可以刺激HK－2細(xì)胞ROCK分子活化。

Fig.1 Effect of glucose 60 mmol·L－1 on activity of Rho－associated coiled－coil for ming pr otein serine／threonine kinase（ROCK）of HK－2 cells detected by co－immunoprecipitation assay.Lanes 1－7：HK－2 cells cultivated with glucose for 0，30 min，1，3，7，12 and 24 h，respectively.A2 and B2 were the semiquantitative results of A1 and B1，respectively.±s，n＝3.＊＊P＜0.01，compared with 0 min group.

2.2 法舒地爾對高糖培養(yǎng)的HK－2細(xì)胞α－SMA表達(dá)的影響

如圖2結(jié)果顯示，與正常對照組比較（圖2 A），高糖60 mmol·L－1培養(yǎng) 72 h 后 HK－2 細(xì) 胞 內(nèi)α－SMA蛋白表達(dá)明顯增多（圖2C），高張組 HK－2細(xì)胞α－SMA蛋白表達(dá)無明顯變化（圖2B），提示高糖可成功誘導(dǎo)HK－2細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換。與高糖組比較，高糖＋法舒地爾20μmol·L－1組α－SMA蛋白表達(dá)減少（圖2D）。

2.3 法舒地爾對高糖培養(yǎng)的HK－2細(xì)胞E－鈣黏素和波形蛋白表達(dá)的影響

如圖3和圖4結(jié)果顯示，與正常對照組比較，高糖60 mmol·L－1培養(yǎng) HK－2細(xì)胞72 h后，細(xì)胞E－鈣黏素表達(dá)明顯減少（P＜0.01），波形蛋白表達(dá)明顯增多（P＜0.01），高張組無明顯變化，提示高糖可以誘導(dǎo)HK－2細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化。與高糖組比較，法舒地爾同步干預(yù)72 h后E－鈣黏素表達(dá)增多（P＜0.01），波形蛋白表達(dá)減少（P＜0.01），且法舒地爾20μmol·L－1組改變更為明顯，法舒地爾3個濃度組組間比較差異有顯著性（P＜0.05），提示法舒地爾可抑制高糖誘導(dǎo)的HK－2細(xì)胞轉(zhuǎn)分化。

Fig.2 Effect of f asudil onα－smooth muscle actin（α－SMA）expression of HK－2 cells cultivated in glucose 60 mmol·L－1 for 72 h detected by i mmunocytochemistry（PI×400）.A：nor mal control group（glucose 5.5 mmol·L－1）；B：glucose 5.5 mmol·L－1＋mannitol 54.5 mmol·L－1（hight tension）；C：glucose 60 mmol·L－1；D：gl ucose 60 mmol·L－1＋fasudil 20μmol·L－1 group.Red color showsα－SMA positive expression.

Fig.3 Effect of fasudil on E－cadherin expression of HK－2 cells cultivated in glucose 60 mmol·L－1 f or 72 h detected by Wester n blotting.B was the semiquantitative result of A.1：normal contr ol gr oup；2：high tension group；3：gl ucose 60 mmol·L－1 group；4，5 and 6：gl ucose 60 mmol·L－1＋fasudil 5，10 and 20 μmol·L－1 gr oups，respectively.±s，n＝3.＊＊P＜0.01，co mpared wit h nor mal contr ol gr oup；＃＃P＜0.01，co mpared wit h glucose 60 mmol·L－1 group.

Fig.4 Effect of f asudil on vi mentin expression of HK－2 cells cultivated in glucose 60 mmol·L－1 for 72 h detected by Wester n blotting.See Fig.3 f or t he legend.B was t he se miquantitative result of A.1：nor mal control group；2：high tension gr oup；3：glucose 60 mmol·L－1 group；4，5 and 6：high glucose 60 mmol·L－1＋fasudil 5，10 and 20μmol·L－1 gr oup，respectively.±s，n＝3.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，co mpared wit h nor mal contr ol gr oup；＃＃P＜0.01，compared with gl ucose 60 mmol·L－1 group.

2.4 法舒地爾對高糖培養(yǎng)的HK－2細(xì)胞CTGF表達(dá)的影響

如圖5結(jié)果顯示，與正常對照組比較，高糖60 mmol·L－1培養(yǎng) HK－2細(xì)胞72 h后，細(xì)胞CTGF表達(dá)明顯增多（P＜0.01），高張組無明顯變化。與高糖組比較，法舒地爾同步干預(yù)72 h后CTGF表達(dá)減少（P＜0.01），且法舒地爾20μmol·L－1組減少更為明顯，法舒地爾3個濃度組組間比較差異有顯著性（P＜0.05）。

Fig.5 Effect of fasudil on connective tissue growth factor（CTGF）expression of HK－2 cells cultivated in glucose 60 mmol·L－1 for 72 h detected by Wester n blotting.See Fig.3 for t he legend.B was t he semiquantitative result of A.1：nor mal control group；2：high tension group；3：glucose 60 mmol·L－1 group；4，5 and 6：gl ucose 60 mmol·L－1＋fasudil 5，10 and 20μmol·L－1 gr oups，respectively.±s，n＝3.＊＊P＜0.01，co mpared wit h normal control group；＃＃P＜0.01，compared with glucose 60 mmol·L－1 group.

3 討論

EMT是指上皮細(xì)胞在某些條件下轉(zhuǎn)分化為肌成纖維細(xì)胞，表現(xiàn)為失去上皮細(xì)胞的標(biāo)志物E－鈣黏素而獲得肌成纖維細(xì)胞的標(biāo)志物α－SMA和波形蛋白。EMT在DN的發(fā)生發(fā)展中起重要作用［14］。本研究結(jié)果表明，HK－2細(xì)胞在高糖60 mmol·L－1條件下培養(yǎng)72 h后，E－鈣黏素的表達(dá)減少，α－SMA和波形蛋白的表達(dá)增多，表明HK－2細(xì)胞在高糖誘導(dǎo)下發(fā)生EMT。因此，尋找新的干預(yù)措施逆轉(zhuǎn)EMT將是治療DN的新策略。

EMT的分子機(jī)制尚未完全闡明。Rho A／ROCK是TGF－β1的下游信號通路之一［15］，是近年的研究熱點。Masszi等［4］研究表明，Rho在 TGF－β1誘導(dǎo)的EMT中起核心作用。Patel等［5］也報道，Rho GTP酶的激活是EMT的關(guān)鍵步驟。本研究發(fā)現(xiàn)高糖60 mmol·L－1能使HK－2細(xì)胞ROCK信號通路激活，表明該通路參與了高糖誘導(dǎo)的EMT。因此推測，抑制ROCK信號通路可以抑制EMT。

法舒地爾是ROCK選擇性抑制劑，通過與ATP競爭ROCK催化區(qū)的ATP結(jié)合位點抑制ROCK的活性［16］。一些體外實驗也證實了法舒地爾在 DN 中的作用。Rodrigues－Díez等［13］報道，法舒地爾可以通過阻斷Rho A／ROCK信號通路抑制血管緊張素Ⅱ引起的HK－2細(xì)胞EMT。Ma等［17］研究發(fā)現(xiàn)，法舒地爾通過抑制高糖所激活的人系膜細(xì)胞Rho A／ROCK信號通路減輕高糖培養(yǎng)的系膜細(xì)胞炎癥和纖維化程度。本研究結(jié)果表明，高糖60 mmol·L－1誘導(dǎo) HK－2細(xì)胞發(fā)生EMT，經(jīng)法舒地爾同步干預(yù)后，細(xì)胞E－鈣黏素的表達(dá)增多，α－SMA和波形蛋白的表達(dá)減少，表明法舒地爾能夠抑制高糖誘導(dǎo)的腎小管EMT，提示法舒地爾對糖尿病性腎小管間質(zhì)病變的治療作用，也進(jìn)一步闡明法舒地爾對DN的治療作用機(jī)制。

CTGF是近年來發(fā)現(xiàn)與纖維化密切相關(guān)的細(xì)胞因子，它通過促進(jìn)基質(zhì)金屬蛋白酶合成、抑制基質(zhì)金屬蛋白酶降解從而引起纖維化的發(fā)生［18］。有研究報道，CTGF可以導(dǎo)致腎小管發(fā)生EMT［19］。本研究發(fā)現(xiàn)，HK－2細(xì)胞在高糖60 mmol·L－1培養(yǎng)條件下培養(yǎng)72 h，CTGF的表達(dá)明顯增多，提示高糖誘導(dǎo)HK－2細(xì)胞發(fā)生EMT可能與CTGF介導(dǎo)有關(guān)。本研究還發(fā)現(xiàn)，高糖培養(yǎng)的HK－2細(xì)胞經(jīng)法舒地爾同步干預(yù)后，CTGF的表達(dá)減少，且隨著法舒地爾濃度的增加作用更加明顯，表明法舒地爾抑制EMT可能部分是通過抑制CTGF的表達(dá)而介導(dǎo)的。

綜上所述，高糖可誘導(dǎo)HK－2細(xì)胞發(fā)生EMT，并能激活ROCK分子；法舒地爾能明顯抑制該EMT過程；法舒地爾抑制EMT的作用可能部分是通過抑制CTGF的表達(dá)而介導(dǎo)的。本研究為法舒地爾的腎保護(hù)作用提供了理論依據(jù)，并進(jìn)一步明確了法舒地爾在DN治療中的應(yīng)用價值。其作用機(jī)制尚需進(jìn)一步探討。

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