王本泉，張 玲，黃 雪，陳宗靜，白永恒，吳存造，周蒙滔，陳必成，

（溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院1.外科實驗室，2.移植中心，浙江 溫州 325000）

近年來研究顯示，胰腺癌的發(fā)生和發(fā)展涉及多種基因突變和表觀遺傳學的變化［1－2］。組蛋白修飾是基因表達的一種表觀遺傳學調(diào)控方式，組蛋白的乙?；癄顟B(tài)在基因的表達調(diào)控中發(fā)揮非常重要的作用。組蛋白乙?；癄顟B(tài)受組蛋白乙酰轉移酶（histone acetyltransferase，HAT）和組蛋白去乙酰化酶（histone deacetylase，HDAC）共同調(diào)節(jié)［3］，組蛋白乙酰化狀態(tài)的失衡可能導致腫瘤的發(fā)生，而HDAC抑制劑可明顯抑制腫瘤的生長［4］。目前，已發(fā)現(xiàn)多種HDAC抑制劑，曲古抑菌素A（trichostatin A，TSA）是其中具代表性的藥物之一。TSA不僅具有抑制腫瘤細胞增殖、誘導分化及化療增敏作用，而且還可誘導細胞凋亡［5］。線粒體凋亡途徑是TSA作用的機制之一［6］，還可能涉及細胞周期調(diào)控、血管生成和死亡受體等多種途徑［7－8］。

c－Jun氨基端激酶（c－Jun N－ter minal kinase，JNK）又稱應激活化蛋白激酶（stress－activated pr otein kinase，SAPK），作為絲裂原活化蛋白激酶（mitogen－activated protein kinase，MAPK）家族中的重要成員，JNK信號通路在細胞分化、細胞凋亡、應激反應以及多種人類疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，是細胞內(nèi)重要的信號轉導通路之一［9－14］。JNK活化可誘導細胞發(fā)生凋亡，多數(shù)研究認為JNK通路活化為化療藥物、紫外線照射等誘導細胞凋亡所必需［15－17］。JNK通路活化是否參與 TSA誘導的胰腺癌細胞凋亡過程尚不清楚。本研究通過觀察JNK通路在TSA誘導PANC－1細胞凋亡中的作用，探討TSA誘導胰腺癌細胞凋亡的可能機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器

TSA和Hoechst33258購自美國Sig ma公司，用二甲亞砜（DMSO，Sig ma）溶解至10μmol·L－1，使用前用無血清培養(yǎng)基稀釋至工作濃度。JNK抑制劑（SP600125）購自上海碧云天生物技術有限公司。DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清、Trizol購自美國Gibco BRL公司。CCK－8試劑盒購自日本同仁化學研究所。逆轉錄試劑盒和SYBRGreenⅠ熒光定量試劑盒購自東洋紡（上海）生物科技有限公司，實時熒光定量PCR所用引物由英駿生物技術有限公司合成（表1）。兔抗人Bax，bcl－2和p－JNK一抗以及辣根過氧化物酶標記山羊抗兔Ig G二抗購于英國Abcam生物公司，胱天蛋白酶3、活性胱天蛋白酶8及p－c－Jun抗體購自美國Cell Signaling公司。Varioskan酶標儀，美國Ther mo公司；ABI7500熒光PCR儀，美國應用生物系統(tǒng)公司；DM4000 M熒光顯微鏡，德國徠卡公司。

Tab.1 Primers used with real－time PCR

1.2 細胞培養(yǎng)及分組處理

胰腺癌PANC－1細胞用含10%胎牛血清、鏈霉素100 g·L－1、青霉素100 g·L－1的DMEM 培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。取對數(shù)生長期的細胞，TSA 0.25，0.5，1和2μmol·L－1處理24 h后，檢測細胞存活率，取1μmol·L－1濃度進行后續(xù)指標檢測實驗。對數(shù)生長期的細胞分3組，正常對照組，加入等量培養(yǎng)液共培養(yǎng)，TSA 1.0和TSA 1.0μmol·L－1＋SP600125 20μmol·L－1組，處理24 h，Hoechst33258染色觀察凋亡細胞，實時定量PCR方法檢測凋亡相關及JNK通路相關基因的表達，Wester n印跡法檢測凋亡相關及JNK通路相關蛋白的表達。

1.3 CCK－8法檢測細胞存活率

收集對數(shù)生長期的PANC－1細胞制成單細胞懸液，以每孔1×104個細胞接種到96孔板（每孔100μl），待細胞貼壁生長融合至80%時，TSA單獨處理，細胞分4組，每組設4個復孔：TSA 0.25，0.5，1和2μmol·L－1。TSA＋SP600125聯(lián)合處理細胞分3組，每組設4個復孔：TSA 1.0μmol·L－1，TSA 1.0μmol·L－1＋SP600125 20和40μmol·L－1組。以不含TSA和SP600125的培養(yǎng)基處理細胞作為細胞對照組。藥物作用24 h后，各孔加入10μl CCK－8，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，酶標儀測定吸光度（A450nm）值，計算細胞存活率。實驗重復3次。細胞存活率（%）＝A實驗組／A對照組×100%。

1.4 Hoechst33258熒光染色法觀察細胞凋亡

按照1.2分組處理的細胞作用24 h后，吸干培養(yǎng)基，用PBS洗2次，4%甲醛液固定10 min，雙蒸水沖洗2次，吸干雙蒸水后，Hoechst33258（5 mg·L－1）室溫下振蕩避光染色5 min，然后用雙蒸水沖洗2次，室溫下涼干后于熒光顯微鏡（激發(fā)波長360 n m，發(fā)射波長450 n m）下觀察，并隨機選取位置進行拍照。每組隨機選取100倍鏡下3個視野，分別計算每個視野細胞凋亡率（%）＝有凋亡小體的細胞數(shù)／細胞總數(shù)×100%。

1.5 實時定量PCR檢測凋亡相關基因及JNK通路相關基因的表達

按照1.2分組處理的細胞作用24 h后，用Trizol試劑盒提取各組細胞的總RNA，每組吸取2μg RNA樣本在10μl體系中進行逆轉錄反應，參照逆轉錄試劑盒說明書進行。取逆轉錄產(chǎn)物1μl進行PCR擴增，PCR擴增體系：5μl 2×SYBR Green熒光定量試劑、2μl引物（上、下游各1μl，終濃度200 n mol·L－1）、2μl反應緩沖液、1μl c DNA。擴增程序為：95℃10 min，95℃15 s，62℃10 s，40個循環(huán)。得到的Ct值用2－△△Ct法計算mRNA表達。檢測靶基因包括腫瘤凋亡相關基因bcl－2和bax，JNK通路相關基因c－f os，c－Jun以及El k1。

1.6 Western蛋白質(zhì)印跡法檢測凋亡相關蛋白及JNK通路相關蛋白的表達

按照1.2分組處理的細胞作用24 h后，每5×106個細胞加100μl細胞裂解液作用20 min后用細胞刮收集細胞，7500×g離心10 min，收集上清液測蛋白濃度；制備12%聚丙烯酰胺分離膠和4%積層膠，樣品5×SDS上樣緩沖液，設置恒壓200 V，電泳60 min；設置恒壓100 V，濕法電轉移60 min；轉膜后的PVDF膜經(jīng)5%脫脂奶粉TBST溶液室溫封閉1 h；然后加一抗（稀釋在5%脫脂奶粉TBST溶液中）4℃孵育過夜，加入相應種屬二抗，室溫孵育1 h，加入ECL發(fā)光液孵育膜5 min，暗室壓片曝光，顯影定影后膠片保存。運用Quantity one軟件分析各個條帶的積分吸光度（integrated absor bance，IA）值，目的蛋白的IA值與相應內(nèi)參蛋白的IA值的比值表示待測蛋白的相對表達水平。分別檢測凋亡相關蛋白Bax，活性胱天蛋白酶8，bcl－2和胱天蛋白酶3蛋白的表達。

同樣按照上述方法，檢測TSA 1.0μmol·L－1處理0，1，2，4和6 h，p－JNK和p－c－Jun蛋白的表達。

1.7 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 TSA對PANC－1細胞存活率的影響

CCK－8法分析結果顯示，TSA 0.25～2μmol·L－1單獨處理，PANC－1細胞的存活率隨著TSA濃度的增加而降低，顯示TSA對細胞存活的抑制作用具有一定的量效關系（r＝0.9564，P＜0.05）（圖1）。若加入SP600125 20 和 40μmol·L－1，PANC－1細胞的存活率較TSA單獨處理明顯增加（P＜0.05），并且SP600125 40μmol·L－1組明顯高于20μmol·L－1組（P＜0.05）（表2）。

Fig.1 Effect of trichostatin A （TSA）on PANC－1 cell viability by CCK－8 method.Cells were treated wit h TSA for 24 h.±s，n＝3.＊P＜0.05，compared with 0.5μmol·L－1 group；＃P＜0.05，compared with TSA 1μmol·L－1 group.

Tab.2 Effect of SP600125 on TSA induced cell viability

2.2 TSA對PANC－1細胞凋亡的影響

Hoechst33258染色發(fā)現(xiàn)，正常對照組細胞，凋亡率為（1.8±0.4）%（圖2 A），TSA 1μmol·L－1組可見細胞核形態(tài)明顯異常，可見多個凋亡小體樣結構（圖 2B），凋亡率為（6.2±4.1）%；TSA＋SP600125組仍可見凋亡細胞，但凋亡率明顯下降，為（3.9±0.9）%（圖2C）（n＝3，P＜0.05）。

Fig.2 Effect of TSA on PANC－1 cell apoptosis（Hoechst33258 staining×400）.See Fig.1 f or t he legend.A：nor mal control group；B：TSA 1μmol·L－1 gr oup；C：TSA＋SP600125 20μmol·L－1 gr oup.Arro ws sho w t he apoptotic body－like str uct ures.

2.3 TSA對PANC－1細胞凋亡相關基因及JNK通路相關基因表達的影響

實時定量RT－PCR分析結果顯示，與正常對照組相比，TSA 1.0μmol·L－1作用PANC－1細胞24 h后，凋亡相關基因bax mRNA表達明顯升高（P＜0.01），bcl－2 mRNA明顯降低（P＜0.01），JNK通路相關基因c－Jun，c－f os和El k1 mRNA明顯升高（P＜0.01）。與 TSA 組相比，TSA＋SP600125組bax mRNA表達明顯降低（P＜0.01），bcl－2 mRNA明顯升高（P＜0.01），c－Jun和c－fos表達明顯降低（P＜0.01），而El k1 mRNA表達亦降低，但無統(tǒng)計學意義（表3）。

Tab.3 Effect of TSA on mRNA expression of bax，bcl－2，c－Jun，c－fos and Elk1 by real ti me RT－PCR

2.4 TSA對PANC－1細胞蛋白表達的影響

TSA 1.0μmol·L－1作用PANC－1細胞1 h后，p－c－Jun和 p－JNK 明顯激活，2 h達峰值（圖 3 A1，A2）。與正常對照組比較，TSA組促凋亡蛋白Bax和活性胱天蛋白酶8的表達明顯升高（P＜0.05）（圖3B1，B2），抗凋亡蛋白bcl－2和胱天蛋白酶3（全長片段）（圖3C1，C2）的表達明顯降低（P＜0.05）。與TSA組比較，TSA＋SP600125組的Bax和活性胱天蛋白酶8（圖3B1，B2）的表達明顯降低（P＜0.05），bcl－2和胱天蛋白酶3的表達明顯升高（P＜0.05）。說明SP600125對TSA誘導的凋亡相關蛋白有一定的影響。

Fig.3 Effect of TSA on p－JNK and p－c－Jun protein（A），Bax and activated caspase 8（B），and bcl－2 and caspase 3 proteins（C）by Wester n blotting.A2，B2 and C3 were t he se miquantitative results of A1，B1 and C1，respectively.A.Lanes 1－5：TSA for 0，1，2，4，and 6 h，respectively.B and C.Lane 1：nor mal control gr oup；lane 2：TSA 1.0μmol·L－1 for 24 h gr oup；lane 3：TSA 1.0μmol·L－1＋SP600125 20μmol·L－1 f or 24 h，respectively.±s，n＝3.＊P＜0.05，co mpared wit h 0 h group；＃P＜0.05，co mpared wit h nor mal contr ol gr oup；△P＜0.05，co mpared wit h TSA group.

3 討論

胰腺癌對化療藥物不敏感，發(fā)展新型化療藥物和化療增敏藥物是改善胰腺癌治療效果的方法之一。HDAC抑制劑可明顯抑制腫瘤細胞增殖，誘導腫瘤細胞分化和凋亡［4］。由于大多數(shù)腫瘤細胞呈高度乙?；癄顟B(tài)［8］，因此具有抑制HDAC活性的藥物已成為抗癌治療的新策略。本研究通過體外實驗證明，TSA可抑制胰腺癌細胞增殖，誘導胰腺癌細胞凋亡，JNK通路參與了TSA誘導細胞凋亡的過程。

TSA因高效、低毒而在腫瘤治療中受到關注［18－20］。目前已有文獻報道，TSA 可通過誘導P53依賴的途徑［21］和死亡受體途徑［8］誘發(fā)胱天蛋白酶級聯(lián)反應［22］，抑制腫瘤細胞生長和誘導細胞凋亡。劉維民等［23］研究結果顯示，TSA作用于人肝癌細胞SMMC－7721后，可增加抑癌基因p53、促凋亡基因bax的表達；汪理等［24］的研究提示，TSA誘導胰腺癌細胞的凋亡可能與其下調(diào)抗凋亡基因bcl－2表達有關。我們前期的研究亦證實，TSA可明顯抑制PANC－1細胞生長，誘導細胞發(fā)生凋亡，且此效應與TSA作用的濃度和時間成正相關［6］。此外，我們還證實在細胞凋亡的過程中，線粒體通路激活，即bax蛋白表達升高，bcl－2蛋白表達降低，進而可能引發(fā)胱天蛋白酶級聯(lián)反應，導致細胞發(fā)生凋亡。

JNK通路參與凋亡過程，已有報道認為JNK通路激活可促進細胞凋亡，但是JNK通路激活卻抑制細胞凋亡亦有報道。目前，研究認為JNK介導細胞凋亡的機制主要包括：① 轉錄因子途徑，即通過調(diào)控相關轉錄因子的轉錄，促進p53，Bax，F(xiàn)asl和TNF等促凋亡蛋白的表達而介導死亡受體途徑和線粒體途徑的細胞凋亡［25］。JNK一旦被激活，磷酸化的JNK即發(fā)生核轉位，激活轉錄因子c－Jun和Elk－1等，還可誘導BH3－only蛋白（Bid，Bad和Egl1）的表達，隨后活化Bax等促凋亡蛋白，后者作用于線粒體，促使細胞色素c釋放入胞漿，細胞色素c和胱天蛋白酶9結合，最終作用于胱天蛋白酶3，激活的胱天蛋白酶3與凋亡底物結合引起細胞凋亡［15，26－29］。② 非轉錄因子途徑，在JNK活化過程中，部分活化的JNK滯留于細胞質(zhì)，它們可直接作用于Bcl－2家族，調(diào)控該家族蛋白的活性，從而介導線粒體途徑的細胞凋亡，此過程沒有新基因的表達。

為了驗證JNK通路在TSA誘導細胞凋亡中的作用，本研究通過加入JNK抑制劑SP600125阻斷JNK通路。實驗結果表明，TSA＋SP600125聯(lián)合組的細胞存活率明顯高于TSA單獨處理組，JNK通路抑制劑明顯降低TSA誘導PANC－1細胞的凋亡效應。TSA作用PANC－1細胞1 h后，JNK信號通路明顯激活，2 h達峰值，表明JNK信號通路可能參與TSA抗腫瘤的機制。高濃度TSA作用24 h后，JNK通路相關基因的表達均較對照組增高。PANC－1細胞bax mRNA，bax蛋白、活性胱天蛋白酶8的表達明顯升高，bcl－2 mRNA和bcl－2蛋白的表達明顯降低，推測TSA可能激活了線粒體凋亡程序，Bax／bcl－2失平衡而導致細胞死亡。阻斷JNK信號通路后，JNK通路相關基因的表達則降低，線粒體凋亡途徑受到抑制，bax mRNA和Bax及活性胱天蛋白酶8蛋白的表達均降低，bcl－2 mRNA和bcl－2蛋白表達升高。亦有研究發(fā)現(xiàn)，在不同類型的細胞中，受不同類型的刺激，JNK通路活化不導致凋亡，而可能促進細胞增殖分化。其可能的解釋為，人體內(nèi)可能存在多種JNK的同工酶，在不同的細胞中，或處于細胞發(fā)育的不同階段，它們的表達水平不同，對刺激的反應方式亦存在差異。TSA在其他類型的腫瘤細胞中是否依賴JNK通路發(fā)揮促凋亡作用尚需要進一步深入研究。

總之，本研究結果表明，TSA可抑制PANC－1細胞增殖，誘導其凋亡，JNK通路可能參與此過程。

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