羊 帆 王 玉

（浙江中醫(yī)藥大學(xué)生物工程學(xué)院，浙江 杭州 310053）

在水溶性酚酸類活性成分中含量高于50%［1］。以往的研究發(fā)現(xiàn)，丹酚酸B 可以明顯改善大鼠急性腦缺血再灌注所致的神經(jīng)細(xì)胞損傷，改善腦缺血引起的行為障礙［2］。本實(shí)驗(yàn)觀察不同的丹酚酸B 濃度對海馬神經(jīng)元缺血再灌注損傷后的影響，以探討丹酚酸B 對腦保護(hù)作用的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試劑及藥物 胰蛋白酶、DMEM 高糖培養(yǎng)基、Neurobasal 培養(yǎng)液、B27 補(bǔ)充物、青霉素、鏈霉素（Gibco公司）；胎牛血清（杭州四季青）；多聚賴氨酸（Sigma）；L-谷氨酰胺（杭州宏博進(jìn)口分裝）；丹酚酸B 標(biāo)準(zhǔn)品（上海同田生物技術(shù)股份有限公司，20120912），丹紅注射液（菏澤步長制藥有限公司，批號：120411）；阿糖胞苷（上海華聯(lián)制藥廠）。

1.2 大鼠海馬神經(jīng)元的分離培養(yǎng) 取新生24 h 內(nèi)的SD 大鼠（浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物中心提供），在無菌條件下分離出雙側(cè)海馬，用0.25%胰蛋白酶消化（37℃、20 min），加入含有10%胎牛血清（FBS）的DMEM 培養(yǎng)基以終止消化，用巴斯德管將組織塊輕輕吹散，制成密度為2×105個(gè)/cm2的單細(xì)胞懸液，接種于涂有多聚賴氨酸的六孔板上，置于37℃含5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。1 d 后細(xì)胞貼壁，全部吸棄DMEM 培養(yǎng)液，換為完全培養(yǎng)基。完全培養(yǎng)基為Neurobasal 培養(yǎng)液加2%B27 補(bǔ)充物、0.5 mM L-谷氨酰胺、1%青、鏈霉素組成。以后每周換液2次，每次換半液。于培養(yǎng)第4日在培養(yǎng)液中加入阿糖胞苷終濃度為10 μM 作用48 h 以抑制膠質(zhì)細(xì)胞的過度生長。經(jīng)免疫熒光鑒定，通過細(xì)胞計(jì)數(shù)器統(tǒng)計(jì)，90%以上的細(xì)胞均為神經(jīng)元。培養(yǎng)第10日的神經(jīng)元用于實(shí)驗(yàn)。

1.3 模型制備 向無糖的人工腦脊液（ACSF）中通入95% N2/5% CO2，通氣的同時(shí)用溶氧儀測定ACSF 中溶解氧的濃度，直至將至0 附近，將原來正常的種植液置換為缺氧缺糖的ACSF 液4 h，造成神經(jīng)元缺氧缺糖損傷，建立海馬神經(jīng)元離體缺氧缺糖（OGD）模型。

1.4 分組與干預(yù) 取OGD 模型建立成功的神經(jīng)元小皿，隨機(jī)分為：OGD 模型組（OGD 4 h 后換回原有含糖的DMEM 培養(yǎng)基，放回含5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)37℃繼續(xù)培養(yǎng)24 h）、丹酚酸B 小、中、大劑量組（OGD 4 h 后加入終濃度分別為5 mg/L、10 mg/L、20 mg/L的丹酚酸B，放回含5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)37℃繼續(xù)培養(yǎng)24 h）及丹紅注射液組（OGD 4 h 后加入終濃度為50 μmol/L的丹紅注射液，放回含5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)37℃繼續(xù)培養(yǎng)24 h）。另設(shè)空白組（加入不經(jīng)缺氧缺糖處理的ACSF，37℃5% CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4 h 后，換回DMEM 高糖培養(yǎng)液，37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)24 h）。劑量的選擇依據(jù)預(yù)試驗(yàn)ED50和LD50值設(shè)定?？疾斓し铀酈 對神經(jīng)元抗自由基損傷的保護(hù)作用機(jī)制。每組重復(fù)3次。

1.5 標(biāo)本采集與檢測 取造模前后及治療前后海馬神經(jīng)元進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察。采用四唑鹽比色法（MTT 法）測定細(xì)胞活力，各組分別取96 孔培養(yǎng)板的8個(gè)孔，缺糖缺氧4 h 后每孔內(nèi)加入MTT（終濃度為5 g/L）20 μL，37℃溫育4 h，然后吸去各孔內(nèi)的液體，每孔內(nèi)再加入二甲基亞砜150μL，待沉淀物充分溶解后用酶標(biāo)儀在570 nm 處測定各孔的OD 值，以代表神經(jīng)元的活性。神經(jīng)元存活率以正常組OD 值的均數(shù)為100%，按存活率（%）=各孔OD 值/正常組OD 值均數(shù)×100%計(jì)算。采用黃嘌呤氧化酶法測定SOD的含量，細(xì)胞上清液的取樣量為0.1 mL，檢測按試劑盒說明書操作，重復(fù)3次；采用硫代巴比妥酸法（TBA）測定MDA的含量，細(xì)胞上清液的取樣量為0.1 mL，檢測按試劑盒說明書操作，重復(fù)3次。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS16.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示，采用單因素方差分析、LSD的多重比較方法。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 OGD 誘導(dǎo)后對海馬神經(jīng)元形態(tài)學(xué)的影響 新生大鼠海馬神經(jīng)元分散培養(yǎng)10 d，神經(jīng)元胞體增大，有明顯的折光性，立體感強(qiáng)，多數(shù)呈錐體狀或多極性，神經(jīng)突起相互聯(lián)絡(luò)成網(wǎng)，細(xì)胞已具有成熟神經(jīng)元的形態(tài)學(xué)特點(diǎn)［3-5］。經(jīng)OGD 誘導(dǎo)，電鏡觀察部分神經(jīng)元胞體出現(xiàn)腫脹，胞體增大，少數(shù)神經(jīng)元胞體出現(xiàn)空泡，突起淡化、解離，神經(jīng)元纖維呈簇狀。

2.2 細(xì)胞的存活率測定 見表1。細(xì)胞進(jìn)過缺氧缺血后細(xì)胞的存活率明顯下降，在進(jìn)行丹酚酸B 給藥后，細(xì)胞存活率有所提高，中劑量的丹酚酸B 效果最佳（P＜0.05）。

表1 各組細(xì)胞存活率比較（%，±s）

表1 各組細(xì)胞存活率比較（%，±s）

與空白組相比，*P＜0.05；與OGD 模型組相比，△P＜0.05。下同。

2.3 SOD 活性與MDA 含量的測定 OGD 模型組中SOD 活性下降，MDA 含量增加；丹酚酸B 組SOD 活性升高，MDA 含量降低，中劑量組效果最佳（P＜0.05）。

表2 各組細(xì)胞上清液中SOD 活性與MDA 含量比較（±s）

表2 各組細(xì)胞上清液中SOD 活性與MDA 含量比較（±s）

3 討論

丹參具有活血祛瘀、養(yǎng)血安神、涼血消腫等功效。丹酚酸是丹參中重要的水溶性有效成分，種類較多，其中丹酚酸B 含量較多，在腦缺血再灌注損傷中功效顯著。腦缺血再灌注過程中出現(xiàn)大量氧自由基是神經(jīng)元級聯(lián)死亡的重要原因。正常情況下體內(nèi)自由基的產(chǎn)生和消除處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)故不發(fā)生自由基連鎖反應(yīng)和組織損傷。氧自由基和超氧自由基產(chǎn)生增多，會(huì)引起細(xì)胞功能紊亂，超氧化物歧化酶（SOD）活力下降，腦組織細(xì)胞生成大量的丙二醛（MDA）。本實(shí)驗(yàn)利用體外培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元建立OGD 模型，體外模擬腦缺血缺氧再灌注損傷模型，檢測SOD 活力與MDA 含量。結(jié)果提示，丹酚酸B 可明顯提高SOD 活性和降低MDA 含量，且中劑量組的效果最優(yōu)，說明丹酚酸B 在腦缺血缺氧再灌注損傷中有明顯的保護(hù)作用。

［1］鐘靜，唐民科，張妍，等.丹酚酸B 對腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)細(xì)胞損傷和神經(jīng)發(fā)生的影響［J］.藥學(xué)學(xué)報(bào)，2007，42（7）：716-721.

［2］Chen YH，Du GH，Zhang JT.Salvianolic acid B protects brain against injuries caused by ischemia-reperfusion in rats［J］.Acta Pharmacol Sin，2009，21（11）：81-84.

［3］Beh IC，Lezoualch F，Trapp T，et al.Glucocorticoids enhanceoxid ative stress induced cell death in hippocampal neuronsin vitro［J］.Endocrinology，2009，138（1）：101-106.

［4］Kiryushko D，Kofoed T，Skladchikova G，et al.A synthetic peptide ligand of neural cell adhesionmolecule（NCAM）.C3d promotes neurito-genesis and synaptogenesis and modulates presynaptic function inprimary cultures of rat hippocampal neurons［J］.J Biol Chem，2010，278（6）：12325-12334.

［5］Ikegaya Y，Itsukaichi-Nishida Y，Ishihara M，et al.Distance of target search of isolated rat hippocampal neuron is about 150 microm［J］.Neuroscience，2010，97（2）：215-217.