胡國恒 胡 哲 盛 望 陳勵競

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410007；2.湖南省湘潭市中心醫(yī)院，湖南 湘潭 411100）

中藥益氣活血方對冠心病心絞痛具有良好的療效。本研究用免疫組織化學(xué)法檢測大鼠缺血心肌微血管計數(shù)（MVC）和微血管密度（MVD）及肝細(xì)胞生長因子（HGF）蛋白表達(dá)，進(jìn)一步闡明益氣活血方保護(hù)缺血心肌細(xì)胞、增進(jìn)缺血心肌血管新生機(jī)制，為缺血性心臟病的中醫(yī)藥治療提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥物 益氣活血組方（湖南中醫(yī)藥大學(xué)附屬一醫(yī)院自制藥）其藥物成分：黃芪1000 g，當(dāng)歸200 g，川芎500 g，丹參500 g。麝香保心丸：批準(zhǔn)文號為國藥準(zhǔn)字Z31 020068；生產(chǎn)廠商為上海和黃藥業(yè)有限公司。

1.2 試劑與食品 大鼠HGF 試劑盒（上海繼錦化學(xué)科技有限公司）；免疫組化染色試劑盒（北京中杉生物技術(shù)有限公司）；HGF 多克隆抗體（武漢博士德生物工程公司）；SABC 試劑盒（SA1022）（武漢博士德生物工程公司）；DAB 顯色劑試劑盒（AR1022）（武漢博士德生物工程公司）等。DH-140 動物人工呼吸機(jī)（浙江醫(yī)科大學(xué)醫(yī)療儀器實(shí)驗(yàn)廠產(chǎn)品）；四道生理記錄儀（成都儀器廠產(chǎn)品）；CS-Ⅵ型攤片烤片機(jī)（湖北孝感市宏業(yè)醫(yī)用儀器有限公司）；MIAS 醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)（北航公司產(chǎn)品）等。

1.3 實(shí)驗(yàn)動物 健康雄性SD 大鼠32 只，體質(zhì)量（230±20）g，購于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動物有限公司。

1.4 造模方法 大鼠飼養(yǎng)1 周后造模，方法依據(jù)文獻(xiàn)報道［1］的方法進(jìn)行。以1%戊巴比妥鈉腹腔注射（40 mg/kg）麻醉，置于手術(shù)臺，四肢皮下連接心電圖電極，氣管插管，連接空氣呼吸機(jī)；于胸骨左旁第3～4 肋間切開皮膚，長約1 cm，逐層分離皮下組織、肌肉，暴露心臟及大血管根部，切開心包，輕擠大鼠胸廓，將心臟擠出，距左冠狀動脈起點(diǎn)約2 mm 處用零號醫(yī)用縫合線結(jié)扎血管，逐層關(guān)胸?；謴?fù)大鼠自主呼吸，撥出氣管內(nèi)插管，手術(shù)過程中分開胸后、縫針后、結(jié)扎后和關(guān)胸后4個點(diǎn)記錄心電圖變化。以心電圖ST 段的改變及左室前壁向外膨脹發(fā)紺為結(jié)扎成功標(biāo)志。術(shù)后腹腔注射青霉素8萬U/只×3 d 以抗感染。

1.5 分組及給藥 造模成功后雄性SD 大鼠32 只完全隨機(jī)方法分成4 組：假手術(shù)組、心肌梗死模型組、麝香保心丸組和益氣活血方組，每組各8 只。于術(shù)后24 h灌胃給藥，每日1次，連續(xù)14 d。假手術(shù)組、模型組均予蒸餾水10 mL/kg 灌胃，麝香保心丸組灌服等劑量藥物（12.13 mg/Kg），益氣活血方組灌服藥液（含益氣活血方生藥3.95 g/kg），末次給藥后禁食24 h，不禁水，腹主動脈取血后處死大鼠，留心臟標(biāo)本。飼養(yǎng)過程中模型組死亡2 只，麝香保心丸組1 只。

1.6 心梗邊緣區(qū)MVC 及MVD 指標(biāo)測量方法 用CD34單克隆抗體免疫組化染色后，血管內(nèi)皮細(xì)胞被染成棕黃色。微血管判斷標(biāo)準(zhǔn)：按參考文獻(xiàn)方法［2-3］以CD34的表達(dá)來標(biāo)記血管內(nèi)皮細(xì)胞，凡是染成棕黃色單個內(nèi)皮細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞簇均作為一個血管計數(shù)，凡管腔大于8個紅細(xì)胞大小、帶有較厚肌層的血管區(qū)域的血管均不計數(shù)。具體方法為：先在40×視野下找到心梗邊緣區(qū)，選取微血管密度最高的區(qū)域，然后在400×視野下（圖像分析系統(tǒng)所取的視野）計數(shù)大鼠心梗邊緣區(qū)新生MVC，并用圖像分析系統(tǒng)測定其MVD，每張切片隨機(jī)選取5個視野，分別測定其MVC，MVD，取平均值作為本例大鼠的MVC，MVD 值。

1.7 免疫組織化學(xué)測定HGF 蛋白表達(dá) 光鏡下觀察，陽性染色細(xì)胞胞漿或胞膜出現(xiàn)黃色或棕黃色顆粒。采用IPP6.0 醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)，每個組每個時間點(diǎn)分別選取5 張切片，每張切片隨機(jī)選取5個視野，測定陽性著色累積光密度（IOD）值，對HGF 進(jìn)行圖像分析。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS16.0 統(tǒng)計軟件。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以表示，采用t 檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠心肌梗死面積比較 見表1。益氣活血方組及麝香保心丸組心肌梗死面積較模型組明顯縮小，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

表1 各組大鼠心肌梗死面積（IS）和缺血心肌HGF 蛋白表達(dá)比較（±s）

表1 各組大鼠心肌梗死面積（IS）和缺血心肌HGF 蛋白表達(dá)比較（±s）

與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與假手術(shù)組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。下同。

2.2 大鼠缺血心肌微血管計數(shù)和微血管密度的比較見表2。益氣活血方組及麝香保心丸組與模型組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

表2 各組大鼠缺血心肌微血管計數(shù)（MVC）和微血管密度（MVD）比較（±s）

表2 各組大鼠缺血心肌微血管計數(shù)（MVC）和微血管密度（MVD）比較（±s）

2.3 大鼠缺血心肌HGF 蛋白表達(dá)的比較 見表1。在光顯微鏡下，各組大鼠心肌組織可見棕黃色蛋白表達(dá)。模型組與假手術(shù)組比較，HGF 蛋白表達(dá)明顯升高（P＜0.05）；益氣活血組方組及麝香保心丸組與假手術(shù)組比較，HGF 蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.01）；益氣活血方組與模型組比較，HGF 蛋白表達(dá)明顯升高（P＜0.05）；益氣活血方組與麝香保心丸組比較，HGF 蛋白表達(dá)有所升高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

3 討論

冠心病的基本病機(jī)為氣虛血瘀，病性屬本虛標(biāo)實(shí)。《金匱要略·胸痹心痛短氣病脈證治》云“陽微陰弦，即胸痹而痛”。陽微即本虛，陰弦即標(biāo)實(shí)。王清任在《醫(yī)林改錯》中指出“元?dú)饧忍?，必不能達(dá)血管，血管無氣必停留而瘀”。氣為血之帥，血為氣之母，心氣虧虛，運(yùn)血無力，致心脈瘀阻，遂發(fā)為胸痹心痛。血瘀則脈絡(luò)不通，不通則痛，是以氣虛為本，血瘀為標(biāo)，故證屬本虛標(biāo)實(shí)。唯有補(bǔ)氣活血并用，方能氣助血行，瘀去脈利。擬創(chuàng)益氣活血方，益氣活血，通絡(luò)止痛。全方由黃芪、當(dāng)歸、丹參、川芎諸藥組成。方中重用黃芪為君，溫陽補(bǔ)氣，氣盛則血行，具有增強(qiáng)機(jī)體抵抗力、調(diào)節(jié)免疫、促進(jìn)抗體合成保護(hù)心腦血管系統(tǒng)等諸多作用。在心血管系統(tǒng)方面，其通過清除自由基、保護(hù)細(xì)胞結(jié)構(gòu)及抗凋亡保護(hù)心?。?-5］。當(dāng)歸補(bǔ)血活血，具有擴(kuò)張冠狀動脈、增加冠脈血流量、降低心肌耗氧量、改善微循環(huán)和抗凝血、抗血栓形成等諸多作用［6］。丹參活血祛瘀，通絡(luò)止痛，其化學(xué)成分丹參酮、丹參素、丹參酚等具有抗動脈粥樣硬化，抗血栓形成的作用，能促進(jìn)心肌缺血或損傷的恢復(fù)，縮小心肌梗死范圍［7-8］。川芎具有擴(kuò)張冠狀動脈，增加冠狀動脈血流量，制血小板凝集，預(yù)防血栓形成，降低心肌的耗氧量，減輕心肌缺血再灌注損傷等作用［9］。三藥共為佐藥。諸藥合用，使痹阻之心脈得以暢通，諸癥自除。

肝細(xì)胞生長因子（HGF）具有促有絲分裂、促血管生成、抗凋亡、抗纖維化、抑制炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)免疫等多種生物學(xué)功能［10-11］。其對血管內(nèi)皮細(xì)胞和上皮細(xì)胞的促有絲分裂作用和抗凋亡作用在各種血管生長因子中是最強(qiáng)大的［12］。在兔、小鼠缺血模型中，HGF 能刺激新生血管生成，且不論在體內(nèi)還是體外試驗(yàn)，HGF的血管生成活性被證實(shí)比血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）及堿性成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF）更為強(qiáng)大［13-14］。HGF 過度表達(dá)能刺激血管新生和側(cè)支血管形成［15］。本研究用免疫組織化學(xué)法檢測缺血心肌MVC 和MVD 及缺血心肌HGF 蛋白表達(dá)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，MVC、MVD 與HGF 蛋白表達(dá)呈正相關(guān)，說明益氣活血方治療缺血性心臟病其機(jī)制可能與其促進(jìn)HGF 表達(dá)相關(guān)。

［1］李貽奎，寧可永，梁嶸，等.大鼠冠狀動脈結(jié)扎心肌缺血模型方法的改進(jìn)［J］.中國新藥雜志，2005，14（2）：427-428.

［2］Nonaka CF，Cavalcante RB，Nogueira RL，et al.Immunohistochemical analysis of bone resorption regulators（RANKL and OPG），angiogenic index，and myofibroblasts in syndrome and nonsyndrome odon-togenic keratocysts［J］.Arch Oral Biol，2012，57（3）：230-237.

［3］張淑娟，王振濤.丹參注射液對心肌梗死后大鼠缺血心肌血管新生的影響［J］.中醫(yī)雜志，2011，52（18）：1590-1592.

［4］仝欣.黃芪主要活性成分的藥理作用［J］.時珍國醫(yī)國藥，2011，22（5）：1246-1249.

［5］朱海燕，黃芪多糖對人心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞缺氧再復(fù)氧損傷后核因子-κB 表達(dá)的影響［J］.遼寧中醫(yī)雜志，2008，35（1）：7-9.

［6］劉芳.當(dāng)歸的心腦血管藥理作用研究進(jìn)展［J］.成寧學(xué)院學(xué)報，2010，24（6）：551-552.

［7］王昕.丹參酮藥理研究及臨床應(yīng)用進(jìn)展［J］.光明中醫(yī)，2011，26（7）：1514-1517.

［8］李驊，王四旺.丹參素的藥理活性與藥物動力學(xué)研究進(jìn)展［J］.西北藥學(xué)雜志，2011，26（4）：310-312.

［9］楊立娟.川芎的藥理作用研究進(jìn)展［J］.黑龍江醫(yī)藥，2010，23（4）：599-600.

［10］Lesko E，Majka M.The biological role of HGF-MET axis in tumor growth and development of metastasis［J］.Front Biosci，2008，13（1）：1271-1280.

［11］Thatch KA，Mendelson KG，Haber MM，et al.Growth factor manipulation of intestinal angiogenesis：a possible new paradigm in the management of inflammatory bowel disease［J］.Surg Res，2009，156：245-249.

［12］Post MJ，Laham R，Sellke FW，et al.Therapeutic angiogenesis in cardiology using protein formulations［J］.Cardiovasc Res，2001，49：522-531.

［13］Morishita R，Sakaki M，Yamamoto K，et al Impairment of collateral，formation in Lp transgenic mice：therapeutic angiogenesis induced by human hepatocyte growth factor gene［J］.Circulation，2001，105（10）：1491-1496.

［14］Taniyama Y，Morishita R，Aoki M，et al.Therapeutic angiogenesis induced by human hepatocyte growth factor gene in rat and rabbit hindlimb ischemia models：preclinical study for treatment of peripheral arterial disease［J］.Gene Ther，2001，8（1）：181-189.

［15］Taniyama Y，Mofishita R，Aoki M，et a1.Angiogensis and antifibrotic action by hepatocyte growth factor in cardiomyopathic hamsters［J］.Circulation，2000，102（2）：246-252.