李方暉，楊海平，覃 飛

1.Zhaoqing University，Zhaoqing 526061，China；2.South China Normal University，Guangzhou 510006，China.

前言

肌肉衰減征（Sarcopenia）作為一種以骨骼肌質(zhì)量和肌力衰減為主要特征的增齡性機(jī)能退化征，長(zhǎng)期以來(lái)為人們所忽視［2，5］。Sarcopenia引發(fā)的骨質(zhì)減少、運(yùn)動(dòng)平衡能力下降將增加肢體殘疾、Ⅱ型糖尿病、心血管病變、關(guān)節(jié)炎、心理疾病等發(fā)生幾率［38］。流行病學(xué)調(diào)查顯示，近13%的60歲以上老年人受Sarcopenia所困擾，該比例在80歲以上老人高達(dá)50%［50］。Sarcopenia發(fā)生機(jī)制與肌肉蛋白質(zhì)合成下降和分解增加及肌細(xì)胞凋亡增加有關(guān)［4，33，43］。

體育運(yùn)動(dòng)是保持骨骼肌整體功能、延緩骨骼肌衰老的最有效方法［4］。文獻(xiàn)報(bào)道，只有較大強(qiáng)度的力量訓(xùn)練才能增加骨骼肌蛋白合成，弱化衰老骨骼肌凋亡信號(hào)，從而阻止肌細(xì)胞大范圍地進(jìn)入凋亡程序而導(dǎo)致Sarcopenia加劇，逆轉(zhuǎn)老年人骨骼肌質(zhì)量和力量下降［4，33，53］。然而，大強(qiáng)度的抗阻訓(xùn)練易增加老年人受傷幾率，且運(yùn)動(dòng)即刻心率增加、血壓升高易引發(fā)老年人心血管疾病。由于耐力運(yùn)動(dòng)會(huì)減損力量練習(xí)積累起來(lái)的骨骼肌質(zhì)量，使得人們對(duì)耐力運(yùn)動(dòng)是否可用于Sarcopenia的防治仍存在爭(zhēng)議［14］。但鑒于耐力運(yùn)動(dòng)具有增強(qiáng)骨骼肌的線粒體功能、提升細(xì)胞抗氧化水平、抑制細(xì)胞凋亡信號(hào)等作用，近年來(lái)，國(guó)內(nèi)、外學(xué)者相繼研究了耐力運(yùn)動(dòng)對(duì)Sarcopenia的防治作用［4，41，47］。漆正堂等［4］通過(guò)對(duì)8月齡老年小鼠進(jìn)行為期4周大強(qiáng)度耐力運(yùn)動(dòng)后發(fā)現(xiàn)，運(yùn)動(dòng)組小鼠股四頭肌和腓腸肌的活性氧含量及其誘導(dǎo)的DNA 氧化損傷顯著性降低，線粒體膜電位顯著增加。但運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度較大會(huì)加劇DNA 氧化損傷和肌細(xì)胞凋亡［4］。Pasini等［41］研究發(fā)現(xiàn)，8周中等強(qiáng)度耐力運(yùn)動(dòng)上調(diào)16月齡老年大鼠骨骼肌線粒體細(xì)胞色素氧化酶C（cytochrome c oxidase，COX）活性的同時(shí)，老年大鼠骨骼肌蛋白質(zhì)合成途徑也得到明顯強(qiáng)化。Song 等［47］進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，8周中等強(qiáng)度耐力運(yùn)動(dòng)后16月齡老年大鼠比目魚(yú)肌的凋亡明顯減少，這跟骨骼肌抗氧化酶活性水平得到提升有關(guān)。

盡管人們通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、蛋白質(zhì)免疫印跡等分子生物學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn)了多種與體育運(yùn)動(dòng)改善Sarcopenia有關(guān)的基因和蛋白，初步揭示出改善骨骼肌線粒體功能、提升細(xì)胞抗氧化活性、促進(jìn)蛋白質(zhì)合成可能是長(zhǎng)期運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練防治Sarcopenia潛在機(jī)制。但由于基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制的復(fù)雜性及蛋白質(zhì)功能多樣性，其中任何一種方法都不能獲得對(duì)疾病發(fā)生和整體代謝過(guò)程的全面認(rèn)識(shí)［4，5，41，47］。蛋白組 學(xué)技術(shù)以其高分辨率、高流通量等優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于對(duì)疾病相關(guān)蛋白標(biāo)示物的篩查及其機(jī)制研究。尤其近年來(lái)在骨骼肌生物學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用較為普遍［8，24，55］。本實(shí)驗(yàn)采 用蛋白組學(xué)技術(shù)，通過(guò)雙向凝膠電泳（2－DE）串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)，研究8周中等強(qiáng)度低負(fù)荷量運(yùn)動(dòng)（60%～75%˙VO2max，每天每次15min，5天／周）對(duì)16月齡増齡大鼠腓腸肌蛋白質(zhì)組表達(dá)圖譜的影響，從系統(tǒng)生物學(xué)角度深入揭示長(zhǎng)期訓(xùn)練延緩Sarcopenia的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

儀器設(shè)備：固相pH 梯度等電聚焦千膠條（Immobilise dry strip pH3－10、長(zhǎng)度18cm，購(gòu)自Amersham 公司）、IPGphor等電聚焦電泳系統(tǒng)（購(gòu)自Amershan Pharmacia公司）、聚丙烯酰胺凝膠電泳垂直平板電泳槽（購(gòu)自bio－rad 公司）、MDLDI－TOF MS質(zhì)譜儀（購(gòu)自Bruker Daltonics公司）、圖像掃描儀（購(gòu)自中晶科技）。

試劑：尿 素、NP－40、載體兩性電解 質(zhì)（Parmalyte 3－10）、PMSF、CHAPS、SDS、溴酚藍(lán)、丙烯酰胺、BIS均為Amersham Pharmacia公司；低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白混合物（兔磷酸化酶B97400、牛血清白蛋白66700、兔肌動(dòng)蛋白43000、牛碳酸配酶31000、胰蛋白酶抑制劑20300、雞蛋清溶菌酶14400）、AP購(gòu)自Bio－rad公司；硫代硫 酸 鈉購(gòu)自Fluka公司；Bradford試劑盒、考馬斯亮藍(lán)G－250、巰基乙醇、甘氨酸、乙腈、碳酸氫氨、鐵氰化鉀、乙醇、乙酸鈉、硝酸銀、甲醛、碳酸鈉、硫脲等均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。

1.2 動(dòng)物分組與運(yùn)動(dòng)方案

12只18月齡雌性Sprague－Dawley大鼠購(gòu)于廣州中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物中心，體質(zhì)量為378±11g，清潔級(jí)。在室溫20℃～24℃、光照時(shí)間7：00—19：00 條件下分籠飼養(yǎng)，每籠4只，自由進(jìn)食和飲水。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，12只大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組和運(yùn)動(dòng)實(shí)驗(yàn)組，每組6只。負(fù)荷強(qiáng)度參照Bejma等［18］實(shí)驗(yàn)中増齡大鼠訓(xùn)練負(fù)荷進(jìn)行。運(yùn)動(dòng)組進(jìn)行8周中等強(qiáng)度低負(fù)荷量運(yùn)動(dòng)（速度15 m／min，跑臺(tái)坡度5°，每組15min，5 天／周），負(fù)荷強(qiáng)度相當(dāng)于60%～70%˙VO2max［18］。

1.3 取材與樣品制備

運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練方案結(jié)束后6h，運(yùn)動(dòng)組和對(duì)照組同時(shí)麻醉，對(duì)大鼠體重和腓腸肌組織進(jìn)行稱重。計(jì)算腓腸肌指數(shù)＝腓腸肌重量（mg）／體重（g）。隨后取腓腸肌80 mg，用液氮碾成粉末狀，按1∶4 比例加入裂液，組內(nèi)合并上清。用Bradford法對(duì)樣品蛋白定量。蛋白濃度按每管1mg分裝。4 ℃振搖30min，組織懸液12 000r／min，4 ℃離心30min，吸取上清－70 ℃冰箱保存待用。

1.4 雙向凝膠電泳（2－DE）與圖像、質(zhì)譜分析

參考張松江等［8］方法進(jìn)行蛋白質(zhì)固相－pH 梯度聚丙烯酰胺凝膠電泳（2－DE），掃膠后進(jìn)行圖像分析，隨后酶解并進(jìn)行質(zhì)譜分析。

1.5 數(shù)據(jù)庫(kù)查詢

依據(jù)NCBI蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)，將質(zhì)譜所測(cè)肽質(zhì)量指紋譜數(shù)據(jù)峰的列表通過(guò)Matrix Science網(wǎng)站提供的搜索引擎Mascot進(jìn)行查詢。查詢參數(shù)：物種來(lái)源鼠；胰蛋白質(zhì)酶水解；酶解片段不完全選擇為1；肽片段相對(duì)分子質(zhì)量最大允許誤差控制在±0.1Da等。

1.6 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，F(xiàn)IN 采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。用Image Master 2DPlatinum V 5.0分析軟件檢驗(yàn)差異蛋白點(diǎn)相對(duì)含量的差別是否有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。差異性檢驗(yàn)顯著性水平設(shè)定為P＜0.05。

2 結(jié)果

2.1 運(yùn)動(dòng)大鼠腓腸肌指數(shù)的改變

表1顯示，8周中等強(qiáng)度低負(fù)荷量運(yùn)動(dòng)后，與對(duì)照組相比，運(yùn)動(dòng)組腓腸肌重量增加了30.0%（P＜0.05），腓腸肌指數(shù)增加37.5%（P＜0.01），但體重沒(méi)有顯著性差異（P＞0.05）。

表1 本研究體重、腓腸肌重量及腓腸肌指數(shù)一覽表Table 1 Weight，Gastrocnemius Weight（GW）and Gastrocnemius Weight Index（GWI）（n＝6）

2.2 雙向凝膠電泳圖譜分析結(jié)果

將電泳所得的凝膠掃描，以對(duì)照組右腓腸肌蛋白質(zhì)2－DE 代表圖譜作為參考膠進(jìn)行PDques軟件分析。結(jié)果表明，運(yùn)動(dòng)組和對(duì)照組的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)數(shù)目分別是（1 943.5±23）和（1 821±35）個(gè)，匹配率分別為77.15%±3.87%和76.67%±3.91%，相關(guān)系數(shù)分別為0.856 和0.909。表明本次實(shí)驗(yàn)獲得了較好的重復(fù)性，已達(dá)到軟件分析的要求。

圖1為對(duì)照組和運(yùn)動(dòng)組大鼠右腓腸肌總蛋白在pH3－10固相膠條上等電聚焦后再經(jīng)SDS－PAGE 分離，并通過(guò)硝酸銀染色得到的代表圖譜。

圖1 本研究對(duì)照組（左）和運(yùn)動(dòng)組（右）大鼠右腓腸肌蛋白質(zhì)2－DE圖譜Figure 1.The 2－DE Maps of Right Gastrocnemius Proteins from the Control Group（left）and the Exercise Group（right）

2.3 腓腸肌蛋白質(zhì)組差異表達(dá)的定量分析結(jié)果

由圖2可見(jiàn)，蛋白質(zhì)分子量多集中在10～130kDa；蛋白質(zhì)等電點(diǎn)（pI）多集中在4.0～7.0，極酸性和極堿性的蛋白很少。經(jīng)PDquest軟件分析，8周中等強(qiáng)度低負(fù)荷量運(yùn)動(dòng)后，運(yùn)動(dòng)組有19 個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)的表達(dá)發(fā)生1 倍以上變化（表2），并在圖2中綠色標(biāo)出，其中，變化倍數(shù)在2 倍以上有6個(gè)；上調(diào)和下調(diào)的2 倍以上的蛋白質(zhì)點(diǎn)分別有3 個(gè)，未見(jiàn)新增與缺失的蛋白質(zhì)點(diǎn)（圖2，表2）。

圖2 本研究運(yùn)動(dòng)8周后表達(dá)量差異點(diǎn)的位置示意圖Figure 2.The Histograms of Protein Spots Changed after 8－week Exercise

2.4 圖譜分析和鑒定

表3顯示了對(duì)表達(dá)量變化2 倍以上6 個(gè)蛋白斑點(diǎn)用質(zhì)譜進(jìn)行鑒定，并于NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)檢索獲得的肽譜和肽段氨基酸的結(jié)果。A02 號(hào)點(diǎn)鑒定出為熱應(yīng)激同源蛋白70，等電點(diǎn)為5.41，相對(duì)分子量為69.961kDa；運(yùn)動(dòng)后下調(diào)2.29倍；A07號(hào)點(diǎn)定為26S蛋白水解酶的調(diào)節(jié)亞基6B，等電點(diǎn)為5.17，相對(duì)分子量44.548kDa，運(yùn)動(dòng)后下調(diào)2.36倍；A15號(hào)點(diǎn)為肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白，等電點(diǎn)為5.81，相對(duì)分子量16.884kDa，運(yùn)動(dòng)后下調(diào)2.06倍；B01號(hào)點(diǎn)為線粒體乙醛脫氫酶2，等電點(diǎn)為5.88，相對(duì)分子量130.361 kDa，運(yùn)動(dòng)后上調(diào)2.67倍；B02號(hào)點(diǎn)為α－酮戊二酸脫氫酶復(fù)合體，等電點(diǎn)為6.30，相對(duì)分子量106.451kDa，運(yùn)動(dòng)后上調(diào)2.51倍；B03號(hào)點(diǎn)為細(xì)胞膜修復(fù)相關(guān)蛋白，等電點(diǎn)為6.26，相對(duì)分子量53.402kDa，運(yùn)動(dòng)后上調(diào)2.54倍。

3 討論

文獻(xiàn)報(bào)道［4，41，47］，不同強(qiáng)度、不同方式的體育運(yùn)動(dòng)均能增加増齡大鼠不同肌纖維類型的骨骼肌質(zhì)量，包括比目魚(yú)肌、股四頭肌、腓腸肌等。本研究表1 顯示，8周中等強(qiáng)度低負(fù)荷量運(yùn)動(dòng)（60%～75%˙VO2max）后腓腸肌重量也增加30.0%，腓腸肌指數(shù)增加37.5%。提示，該運(yùn)動(dòng)方案能防止Sarcopenia的肌肉質(zhì)量下降。因此，本研究在此運(yùn)動(dòng)模型的基礎(chǔ)上選取腓腸肌進(jìn)一步研究骨骼肌蛋白質(zhì)組圖譜的變化。2－DE 聯(lián)合質(zhì)譜技術(shù)能靈敏的反映不同生理或病理刺激下的骨骼肌蛋白 質(zhì)組 變 化［8，24，55］。近年來(lái)，人們應(yīng)用2－DE聯(lián)合質(zhì)譜技術(shù)研究了不同強(qiáng)度長(zhǎng)期訓(xùn)練誘導(dǎo)骨骼肌適應(yīng)性應(yīng)答機(jī)制［24］、一次性離心運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致肌纖維微損傷及其運(yùn)動(dòng)性疲勞的分子機(jī)制［55］、體育運(yùn)動(dòng)改善Ⅱ型糖尿病患者骨骼肌胰島素敏感性的分子機(jī)制［1］。為深入揭示骨骼肌生物學(xué)調(diào)控機(jī)制提供新的思路［8，24，55］。本研究應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)方法首次分析了中等強(qiáng)度低負(fù)荷量運(yùn)動(dòng)對(duì)增齡大鼠腓腸肌蛋白質(zhì)組差異表達(dá)，并對(duì)差異2 倍以上的6種蛋白進(jìn)行質(zhì)譜鑒定，鑒定出了熱應(yīng)激同源蛋白70、26S 蛋白酶體調(diào)節(jié)亞基6B、肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白Cofilin、線粒體乙醛脫氫酶2、α－酮戊二酸脫氫酶復(fù)合體、細(xì)胞膜修復(fù)相關(guān)蛋白TRIM72，分別參與細(xì)胞凋亡、蛋白質(zhì)水解、線粒體功能、肌細(xì)胞膜修復(fù)等功能調(diào)控。同時(shí)，結(jié)合已有文獻(xiàn)報(bào)道，本研究將對(duì)這6種蛋白是否由長(zhǎng)期訓(xùn)練引起適應(yīng)性改變進(jìn)行分析，進(jìn)而有利于揭示體育運(yùn)動(dòng)延緩骨骼肌衰老的分子機(jī)制。

表2 本研究運(yùn)動(dòng)后差異表達(dá)大于1倍的蛋白質(zhì)點(diǎn)一覽表Table 2 The Protein Spots Whose Expression Different＞1Folds after Training

表3 本研究運(yùn)動(dòng)后部分差異表達(dá)蛋白點(diǎn)質(zhì)譜鑒定結(jié)果一覽表Table 3 Identification of Differential Expressed Protein Spots by MS／MS after Exercise

3.1 熱休克同源蛋白70

熱休克同源蛋白70（heat shock cognate 70kDa protein，HSC70）也稱為組成型熱休克蛋白70（HSP70），與誘導(dǎo)型熱休克蛋白70（HSP70）共同組成HSP70 家族，兩者氨基酸序列近85%相似。盡管在結(jié)構(gòu)上相似，但氨基酸序列的氨基末端差異使兩者呈現(xiàn)功能特異性。HSC70 在大多數(shù)細(xì)胞都有較高的含量。非折疊蛋白產(chǎn)生后，HSC70 迅速遷移核中，與非折疊核糖體前體和變性蛋白質(zhì)特異性的結(jié)合，參與維持其底物蛋白正常的空間構(gòu)象。然而，對(duì)于無(wú)法進(jìn)行修復(fù)的錯(cuò)誤折疊蛋白，HSC70 和HSP70 形成二聚體后再與其結(jié)合，從而有利于26S蛋白酶體的識(shí)別并對(duì)錯(cuò)誤折疊蛋白進(jìn)行特異性水解［34］。因此，HSC70 對(duì)于胞內(nèi)蛋白質(zhì)“質(zhì)量控制”及蛋白質(zhì)內(nèi)穩(wěn)態(tài)的維持起重要作用。

文獻(xiàn)也報(bào)道［16，21，46］，HSC70可調(diào)控細(xì)胞程序性死亡過(guò)程。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)［46］，體外高濃度葡萄糖培養(yǎng)或培養(yǎng)過(guò)程中添加蛋白激酶抑制劑處理誘導(dǎo)的神經(jīng)元細(xì)胞凋亡過(guò)程中發(fā)現(xiàn)HSC70 蛋白表達(dá)顯著性增加。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，肌萎縮側(cè)索硬化癥誘導(dǎo)的神經(jīng)元細(xì)胞凋亡過(guò)程中HSC70 蛋白表達(dá)也明顯上調(diào)［21］。Boyd－Kimball等［16］用2－DE 聯(lián)合質(zhì)譜研究了神經(jīng)退行性疾病患者的不同腦區(qū)的蛋白差異表達(dá)，結(jié)果表明，神經(jīng)退行性疾病相關(guān)的神經(jīng)元細(xì)胞凋亡與HSC70表達(dá)增加有關(guān)。Burté等［17］研究發(fā)現(xiàn)，HSC70 表 達(dá)增加與線粒體功能失調(diào)所引發(fā)的氧化應(yīng)激及錯(cuò)誤折疊蛋白積累有關(guān)。Matsui等［35］在紅細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)了HSC70可維持促凋亡因子Bim（bcl－2interacting mediator of cell death，Bim）信使核糖核酸（message RNA，mRNA）的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。值得指出的是，Bim 在骨骼肌細(xì)胞凋亡過(guò)程中起重要作用［3］。

Chen等［19］研究了18個(gè)月的自愿鍛煉和耐力運(yùn)動(dòng)對(duì)5月齡大鼠海馬神經(jīng)元的蛋白質(zhì)組影響，結(jié)果表明，長(zhǎng)期耐力運(yùn)動(dòng)的大鼠認(rèn)知功能得到改善的同時(shí)，海馬神經(jīng)元的HSC70蛋白表達(dá)顯著降低。盡管Chen 等［19］沒(méi)有觀察海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡，但Chen等［19］實(shí)驗(yàn)中安靜組大鼠是23月齡。Chen G 等［20］研究發(fā)現(xiàn)，18月齡SD大鼠海馬神經(jīng)元凋亡率明顯增加，后者誘發(fā)認(rèn)知功能障礙。提示，長(zhǎng)期體育運(yùn)動(dòng)可預(yù)防老齡大鼠的認(rèn)知功能障礙與抑制海馬神經(jīng)元凋亡有關(guān)，而后者與HSC70 蛋白表達(dá)降低相關(guān)。由于Chen等［19］實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭械拇笫蠼?jīng)歷了18 個(gè)月長(zhǎng)期跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)，說(shuō)明HSC70 蛋白表達(dá)降低是長(zhǎng)期訓(xùn)練帶來(lái)的適應(yīng)性改變。本研究表3 顯示，8周中等強(qiáng)度低負(fù)荷量運(yùn)動(dòng)大鼠腓腸肌的HSC70蛋白表達(dá)減少。結(jié)果說(shuō)明，8周中等強(qiáng)度低負(fù)荷量運(yùn)動(dòng)引起的骨骼肌HSC70 蛋白表達(dá)減少同樣是長(zhǎng)期訓(xùn)練所引起的適應(yīng)性改變。由此推測(cè)，長(zhǎng)期中等強(qiáng)度低負(fù)荷量運(yùn)動(dòng)通過(guò)誘導(dǎo)HSC70 表達(dá)減少來(lái)弱化HSC70／Bim 軸活性，進(jìn)而抑制Sarcopenia 肌細(xì)胞凋亡；此外，作為適應(yīng)性應(yīng)激因子，HSC70 表達(dá)適應(yīng)性下調(diào)可能與細(xì)胞氧化應(yīng)激及錯(cuò)誤折疊蛋白相關(guān)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激程度減輕有關(guān)。從下文鑒定的α－酮戊二酸脫氫酶、線粒體醛脫氫2、26S蛋白酶體調(diào)節(jié)亞基6B間接證實(shí)這一假設(shè)。

3.2 26S蛋白酶體調(diào)節(jié)亞基6B分子

26S蛋白酶體由圓桶狀的20S 蛋白酶體和多種調(diào)節(jié)復(fù)合物組成。調(diào)節(jié)復(fù)合物中最常見(jiàn)的有19S調(diào)節(jié)復(fù)合體。ATP 存在情況下，19S調(diào)節(jié)復(fù)合物與20S蛋白酶體組裝成有活性的26S蛋白酶體。19S調(diào)節(jié)復(fù)合體至少有20 多個(gè)亞基組成，其中包含兩個(gè)亞結(jié)構(gòu)，分別是“蓋子”和“基底”。26S蛋白酶體調(diào)節(jié)亞基6B 分子（26Sprotease regulatory subunit 6B，S6B）是19S調(diào)節(jié)復(fù)合體的基底部成員之一，具有ATP 水解酶活性。在識(shí)別并結(jié)合泛素化的底物之后，S6B水解ATP 打開(kāi)折疊結(jié)構(gòu)、改變構(gòu)象和去除泛素，主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)展開(kāi)的蛋白到20S蛋白酶體，使底物蛋白質(zhì)進(jìn)入20S降解復(fù)合體，進(jìn)行靶蛋白特異性酶解［10］。

蛋白質(zhì)合成減少、分解增加導(dǎo)致蛋白質(zhì)大量丟失是Sarcopenia重要機(jī)制［43］。Bardag－Gorce等［15］研究發(fā)現(xiàn)，18～32月齡大鼠19S 調(diào)節(jié)復(fù)合體的mRNA 表達(dá)持續(xù)性增加，但介導(dǎo)蛋白質(zhì)水解過(guò)程的泛素mRNA 沒(méi)有增加。提示，26S蛋白酶體在Sarcopenia蛋白質(zhì)過(guò)度水解過(guò)程中起更重要的作用。Altun等［11］研究證實(shí)，與4月齡青年大鼠相比，30月齡大鼠骨骼肌26S蛋白酶體表達(dá)增加3 倍。盡管單次損傷性的離心運(yùn)動(dòng)可使26S蛋白酶體途徑活性增加［51］，但重復(fù)性耐力和力量訓(xùn)練具有抑制泛素蛋白酶體活性的作用［10，27］。說(shuō)明骨骼肌26S 蛋白酶體的活性變化與運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度和運(yùn)動(dòng)方式相關(guān)。Willoughby 等［52］讓脊髓損傷患者做12周被動(dòng)腿部自行車康復(fù)訓(xùn)練，結(jié)果顯示，肌球蛋白重鏈mRNA 含量顯著增加，26S 蛋白酶體mRNA 水平卻下降。Kee等［27］對(duì)大鼠進(jìn)行連續(xù)5 天遞增負(fù)荷運(yùn)動(dòng)，并于24h后取材，結(jié)果表明，骨骼肌26S 蛋白酶體蛋白表達(dá)減少。結(jié)合Willoughby等［52］和Kee等［27］不難看出，運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練下調(diào)骨骼肌26S 蛋白酶體蛋白表達(dá)是適應(yīng)性過(guò)程。本研究表3顯示，8周中等強(qiáng)度低負(fù)荷量運(yùn)動(dòng)后，大鼠腓腸肌S6B蛋白表達(dá)也呈現(xiàn)適應(yīng)性地減少。提示，長(zhǎng)期中等強(qiáng)度低負(fù)荷量運(yùn)動(dòng)能抑制衰老骨骼肌26S蛋白酶體活性水平，有利于減少蛋白質(zhì)過(guò)度水解。結(jié)合Pasini等［41］研究發(fā)現(xiàn)的體育運(yùn)動(dòng)上調(diào)16月齡老年大鼠骨骼肌蛋白質(zhì)合成途徑可推測(cè)，中等強(qiáng)度低負(fù)荷量運(yùn)動(dòng)從抑制蛋白質(zhì)分解和促進(jìn)蛋白質(zhì)合成兩個(gè)途徑共同拮抗Sarcopenia的骨骼肌蛋白質(zhì)丟失。

3.3 肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白

作為一種低分子量（21kD）的肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白，Cofilin基本功能是結(jié)合并解聚F肌動(dòng)蛋白（F－actin），通過(guò)影響F－actin骨架重組調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。哺乳動(dòng)物的cofilin基因分別編碼Cofilin1 和Cofilin2 兩種亞型，在肌肉發(fā)育以及胚胎期到出生早期都有表達(dá)。在肌原纖維形成早期促進(jìn)肌動(dòng)蛋白絲重組。研究發(fā)現(xiàn)［13］，cofilin基因缺失將導(dǎo)致新生小鼠肌節(jié)Z線在第7 天起出現(xiàn)明顯斷裂。另，cofilin表達(dá)減少導(dǎo)致F－actin無(wú)法解聚，引發(fā)骨骼肌肌?。?1］。

文獻(xiàn)報(bào)道［49］，cofilin蛋白從胞漿中轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入肌細(xì)胞線粒體中將誘導(dǎo)細(xì)胞色素C 釋放，后者導(dǎo)致促凋亡因子半胱氨酸蛋白酶3（caspase－3）及其線粒體依賴的凋亡途徑活化，引發(fā)肌細(xì)胞凋亡。Donoghue等［23］比較青年和老齡大鼠腓腸肌的蛋白差異表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，骨骼肌衰老過(guò)程中骨骼肌的Cofilin蛋白表達(dá)顯著增加。提示，Cofilin可能介導(dǎo)Sarcopenia的骨骼肌凋亡過(guò)程。Vainshtein等［49］研究發(fā)現(xiàn)，10周自愿轉(zhuǎn)輪運(yùn)動(dòng)抑制Cofilin進(jìn)入線粒體，從而降低c－jun氨基末端激酶的磷酸化水平及其下游線粒體相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)因子（apoptosis inducing factor，AIF）表達(dá)、Bax／bcl－2 比值；同時(shí)上調(diào)線粒體COX 活性，最終抑制氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的肌細(xì)胞凋亡。Vainshtein等［49］研究說(shuō)明，抑制老齡大鼠骨骼肌Cofilin蛋白表達(dá)、阻止Cofilin轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入線粒體是長(zhǎng)期運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練誘導(dǎo)骨骼肌適應(yīng)性應(yīng)答的過(guò)程。本研究表3 結(jié)果顯示，8周中等強(qiáng)度低負(fù)荷量運(yùn)動(dòng)后老齡大鼠腓腸肌Cofilin蛋白表達(dá)顯著性減少。結(jié)合前文發(fā)現(xiàn)的HSC70，說(shuō)明長(zhǎng)期中等強(qiáng)度低負(fù)荷量運(yùn)動(dòng)通過(guò)共同調(diào)節(jié)Cofilin 和HSC70適應(yīng)性表達(dá)來(lái)保護(hù)Sarcopenia肌細(xì)胞凋亡；另，從下文看出，中等強(qiáng)度低負(fù)荷量運(yùn)動(dòng)還通過(guò)上調(diào)線粒體代謝酶的適應(yīng)性表達(dá)來(lái)促進(jìn)肌細(xì)胞存活，如α－酮戊二酸脫氫酶和線粒體醛脫氫2表達(dá)。這也得到Vainshtein等［49］研究的證實(shí)。Vainshtein等［49］研究揭示了線粒體COX 活性在10周耐力運(yùn)動(dòng)后明顯適應(yīng)性上調(diào)。

3.4 線粒體乙醛脫氫酶2

線粒體乙醛脫氫酶2（aldehyde dehydrogenase 2，ALDH2）是NAD（P）＋依賴的醛脫氫酶超家族的成員之一，具有脫氫酶和脫酯酶催化活性。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的人體中共表達(dá)19種線粒體乙醛脫氫酶（Aldehyde dehydrogenase，ALDHs）亞型，常見(jiàn)的有ALDH1－ALDH4 4種。其中的ALDH2位于線粒體，而ALDH1、ALDH3、ALDH4 則位于胞漿［36］。Stewart等［45］通過(guò)Northern雜交技術(shù)分析人體不同組織器官的ALDHs分布，結(jié)果顯示，ALDH2 在心肌、骨骼肌、脾臟以及肝臟表達(dá)豐度最高。ALDH2 結(jié)構(gòu)為四聚體蛋白，每個(gè)亞基前體由517 個(gè)氨基酸殘基組成，成熟亞基由500個(gè)氨基酸組成。ALDH2可分解乙醛及其衍生物4－氫壬烯醛（4－HNE），減輕醛類對(duì)細(xì)胞的氧化損傷。ALDH2活性降低可使乙醛向乙酸鹽的分解過(guò)程受阻，使體內(nèi)乙醇代謝中間產(chǎn)物乙醛濃度增高，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)乙醛積聚，由于醛類物質(zhì)具有很強(qiáng)的氧化性和細(xì)胞毒性，故引起ALDH2失活的因素均可導(dǎo)致醛類物質(zhì)堆積，對(duì)機(jī)體組織造成不可逆的損傷。研究發(fā)現(xiàn)［39］，除了將進(jìn)入體內(nèi)乙醇氧化為無(wú)毒性的乙酸之外，ALDH2 還具有抗氧化和抗凋亡的效應(yīng)。

ALDH2在心肌、皮膚、神經(jīng)、肝臟、晶狀體等組織的功能基本清楚，但在骨骼肌中鮮見(jiàn)報(bào)道。機(jī)體衰老過(guò)程常伴有ALDH2活性降低或表達(dá)下降［40］。通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)、給予ALDH2興奮劑及長(zhǎng)期訓(xùn)練等手段來(lái)增加ALDH2 活性水平能拮抗衰老導(dǎo)致的心肌細(xì)胞和海馬神經(jīng)元凋亡，延緩衰老［9，12］。Alvarez－López等［12］采用基因芯片技術(shù)分析了6周自由輪轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)對(duì)快速老化小鼠海馬神經(jīng)元基因組差異表達(dá)的影響，結(jié)果顯示，ALDH2表達(dá)上調(diào)可能介導(dǎo)長(zhǎng)期訓(xùn)練延緩快速老化小鼠海馬的衰老過(guò)程。Alvarez－López等［12］進(jìn)一步說(shuō)明，6周自由輪轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)刺激海馬神經(jīng)元ALDH2基因表達(dá)是適應(yīng)性過(guò)程。本研究表3 證實(shí)，8周中等強(qiáng)度低負(fù)荷量運(yùn)動(dòng)刺激老年大鼠骨骼肌ALDH2蛋白同樣也可能是骨骼肌適應(yīng)性應(yīng)答過(guò)程。然而，ALDH2 是否具有抗骨骼肌凋亡的作用有待深入研究揭示。

3.5 α－酮戊二酸脫氫酶復(fù)合體

α－酮戊二酸脫氫酶復(fù)合體（α－ketoglutarate dehydrogenase complex，α－KGDH）主要由3個(gè)酶（α－酮戊二酸脫氫酶、琥珀?；D(zhuǎn)移酶、二氫硫辛酸脫氫酶）和5 個(gè)輔助因子（焦磷酸硫胺素、硫辛酸、輔酶A、輔酶Ⅰ、黃素腺嘌呤二核苷酸）共同組成。α－KGDH 是三羧酸循環(huán)的限速酶，主要通過(guò)催化α－酮戊二酸氧化脫羧后生成琥珀酰輔酶A。衰老相關(guān)的氧化應(yīng)激能導(dǎo)致機(jī)體的α－KGDH 活性和基因表達(dá)下調(diào)，進(jìn)而引發(fā)神經(jīng)、骨骼肌及心肌線粒體功能失調(diào)和細(xì)胞凋亡。Hansford等［25］研究發(fā)現(xiàn)，與青年大鼠（6月齡）相比，老齡大鼠（24月齡）的比目魚(yú)α－KGDH 活性顯著降低。人體實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步表明，老年人（61～74歲）有氧耐力下降與骨骼 肌α－KGDH活性降低有關(guān)［28］。Kim 等［29］應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)手段研究缺血／再灌注大鼠心肌損傷的差異蛋白表達(dá)，結(jié)果表明，α－KGDH 蛋白表達(dá)降低與缺血誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡有關(guān)。Yan等［54］分析了年輕與老齡猴子的左心室肌蛋白差異表達(dá)，結(jié)果同樣發(fā)現(xiàn)，衰老引發(fā)的心肌病變與左心室肌α－KGDH 蛋白表達(dá)減少有關(guān)。然而，補(bǔ)充肉堿可上調(diào)老齡大鼠骨骼肌α－KGDH 活性，后者有利于增強(qiáng)線粒體電子傳遞鏈耦合，進(jìn)而改善老齡大鼠骨骼肌能量狀態(tài)［31］。

表3顯示，8周中等強(qiáng)度低負(fù)荷量運(yùn)動(dòng)老齡大鼠腓腸肌α－KGDH蛋白表達(dá)增加2.5倍。Tikkanen等［48］的人體實(shí)驗(yàn)證實(shí)，以家庭為基礎(chǔ)的12月運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練能增加中老年男性的骨骼肌α－KGDH 活性。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)［30］，長(zhǎng)期低強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)可增加Duchenne型肌營(yíng)養(yǎng)不良模型小鼠（mdx小鼠）骨骼肌α－KGDH 活性，后者可降低mdx小鼠骨骼肌的氧化應(yīng)激損傷。說(shuō)明，α－KGDH 表達(dá)改變是長(zhǎng)期訓(xùn)練導(dǎo)致骨骼肌適應(yīng)性應(yīng)答的結(jié)果。結(jié)合3.4 推測(cè)，α－KGDH 與ALDH2表達(dá)的適應(yīng)性改變可能在長(zhǎng)期訓(xùn)練改善増齡大鼠骨骼肌線粒體功能、抑制肌細(xì)胞凋亡的過(guò)程中起協(xié)同作用。但有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

3.6 細(xì)胞膜修復(fù)相關(guān)蛋白

細(xì)胞膜修復(fù)相關(guān)蛋白（tripartite motif－containing protein 72，TRIM72）是TRIM 家族蛋白之一，也稱為MG53（mitsugumin 53）。Trim 72 主要表達(dá)在骨骼肌和心肌中，介導(dǎo)肌肉細(xì)胞膜損傷的正常修復(fù)及骨骼肌胰島素抵抗、心肌缺血／再灌注損傷等病理過(guò)程［7］。作為骨骼肌胰島素信號(hào)的負(fù)性調(diào)控因子，TRIM72 通過(guò)與E3 泛素連接酶結(jié)合來(lái)調(diào)節(jié)胰島素受體和IRS1泛素依賴的降解過(guò)程［44］。細(xì)胞膜損傷修復(fù)過(guò)程中，TRIM72 直接轉(zhuǎn)位到膜損傷的部位，與磷脂酰絲氨酸和另一種參與細(xì)胞膜自身修復(fù)有關(guān)的跨膜蛋白Dysferlin特異性結(jié)合，從而加速膜修復(fù)過(guò)程［37］。Jung等［26］研究發(fā)現(xiàn)，TRIM72啟動(dòng)子區(qū)的E－box元件上具有促進(jìn)成肌調(diào)節(jié)因子（MyoD）和肌增強(qiáng)因子2（MEF2）基因轉(zhuǎn)錄的保守位點(diǎn)。提示，TRIM72 可通過(guò)增加MyoD 和MEF2基因轉(zhuǎn)錄來(lái)促進(jìn)成肌細(xì)胞分化，加速肌肉損傷后的再生過(guò)程。然而，TRIM72 基因缺陷會(huì)導(dǎo)致小鼠的運(yùn)動(dòng)能力降低、膜修復(fù)功能缺陷，并引發(fā)骨骼肌萎縮［32］。Cao等［22］對(duì)心肌研究發(fā)現(xiàn)，缺血／再灌注會(huì)導(dǎo)致心肌TRIM72 表達(dá)下調(diào)；缺血預(yù)適應(yīng)或TRIM72過(guò)表達(dá)能抑制氧化應(yīng)激誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡，但缺血預(yù)適應(yīng)對(duì)敲除TRIM72 基因的心肌細(xì)胞保護(hù)作用則完全消失。推測(cè)，TRIM72 在促進(jìn)骨骼肌膜損傷位點(diǎn)修復(fù)的同時(shí)，也可能抑制肌細(xì)胞凋亡。

尹苗苗等［6］研究發(fā)現(xiàn)，6周大強(qiáng)度耐力運(yùn)動(dòng)可使14周齡小鼠股四頭肌的TRIM72 表達(dá)增加2.1 倍。尹苗苗等［6］進(jìn)一步表明，骨骼肌TRIM72 表達(dá)增加是長(zhǎng)期訓(xùn)練引起的適應(yīng)性過(guò)程。本研究表3 同樣顯示，8周中等強(qiáng)度低負(fù)荷量運(yùn)動(dòng)后，大鼠腓腸肌TRIM72 表達(dá)增加2.5 倍。說(shuō)明體育運(yùn)動(dòng)可通過(guò)誘導(dǎo)TRIM72 適應(yīng)性表達(dá)來(lái)加速骨骼肌損傷的修復(fù)過(guò)程［6］，進(jìn)而維持肌細(xì)胞膜的完整性。然而，TRIM72是否介導(dǎo)體育運(yùn)動(dòng)保護(hù)Sarcopenia骨骼肌凋亡有待進(jìn)一步研究。圖3 總結(jié)了體育運(yùn)動(dòng)可能通過(guò)調(diào)控以下3個(gè)途徑保護(hù)Sarcopenia。

圖3 8周中等強(qiáng)度低負(fù)荷量運(yùn)動(dòng)保護(hù)sarcopenia的可能機(jī)制示意圖Figure 3.A Hypothesis for Explaining how 8 Weeks Low－loads of Medium Intensity Exercise Protecting Sarcopenia

4 結(jié)論

1.8 周中等強(qiáng)度低負(fù)荷量運(yùn)動(dòng)后增齡大鼠腓腸肌蛋白質(zhì)組發(fā)生了顯著性地變化。

2.成功篩選鑒定出6種目標(biāo)差異蛋白，其表達(dá)量發(fā)生適應(yīng)性變化提示，8周中等強(qiáng)度低負(fù)荷量運(yùn)動(dòng)可能通過(guò)同時(shí)調(diào)控以下3個(gè)途徑保護(hù)Sarcopenia：1）通過(guò)調(diào)控衰老骨骼肌線粒體代謝相關(guān)酶、肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白、熱休克同源蛋白70以及細(xì)胞膜修復(fù)相關(guān)蛋白表達(dá)來(lái)抑制骨骼肌細(xì)胞凋亡過(guò)程；2）通過(guò)下調(diào)26S 蛋白水解酶表達(dá)抑制蛋白質(zhì)分解，進(jìn)而拮抗Sarcopenia骨骼肌蛋白質(zhì)丟失；3）促進(jìn)細(xì)胞膜修復(fù)相關(guān)蛋白表達(dá)改善Sarcopenia的肌細(xì)胞膜修復(fù)功能。

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