趙玉嬋 李蓮 張連梅 劉曉蘭

宮頸癌是最常見的女性生殖道惡性腫瘤之一，其發(fā)生發(fā)展是涉及多基因、多階段的復(fù)雜變化過程，核轉(zhuǎn)錄因子-κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)是其中重要的一種核轉(zhuǎn)錄因子，參與調(diào)控多種細(xì)胞因子、粘附因子的轉(zhuǎn)錄過程，在炎癥、免疫反應(yīng)及腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用［1］。MMP-9(matrix metalloproteinase)是細(xì)胞外基質(zhì)降解的關(guān)鍵酶，有研究發(fā)現(xiàn)MMP-9 在多種惡性腫瘤中過表達(dá)，參與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移過程［2］。但有關(guān)宮頸癌組織NF-κB 和MMP-9 表達(dá)狀況的研究甚少報(bào)道。本研究采用免疫組織化學(xué)SP 法檢測(cè)宮頸癌(CSES)、子宮頸上皮內(nèi)瘤樣變(CIN)及正常子宮頸組織(NCE)中NF-κB 和MMP-9 蛋白的表達(dá)狀況，分析其與臨床病理特征的關(guān)系及意義，為闡明宮頸癌侵襲和轉(zhuǎn)移的機(jī)制及判斷預(yù)后提供科學(xué)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取我院2010 年8 月至2011 年12 月手術(shù)切除、且經(jīng)病理確診的宮頸癌組織存檔蠟塊標(biāo)本80 例?；颊呔鶠榕?，年齡30 ～68 歲，平均年齡46.5 歲。所有患者均無肝、腎及免疫系統(tǒng)疾病，術(shù)前均未接受放療、化療和內(nèi)分泌治療，臨床病理資料完整。宮頸癌病理分級(jí)及臨床分期分別參照WHO(1999 年)和FIGO(1996 年)制定的標(biāo)準(zhǔn)。病理分級(jí):高分化21 例，低分化14 例，中分化45 例;臨床分期:Ⅰa 期13 例，Ⅰb期15 例，Ⅱa 期18 例，Ⅱb 期22 例，Ⅲ期以上12 例。80 例乳腺癌中有腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者32 例，無腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者48例。同時(shí)選取經(jīng)宮頸活檢證實(shí)為子宮頸上皮內(nèi)瘤樣變(CIN)70例(CINⅠ19 例，CINⅡ25 例，CINⅢ26 例)及正常子宮頸組織(NCE)50 例作為對(duì)照。3 組患者的年齡和體重相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)。

1.2 主要試劑兔抗人NF-κB 多克隆抗體、兔抗人MMP-9 多克隆抗體購自Santa Cruz 公司。免疫組化SP 試劑盒購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法標(biāo)本用10%甲醛固定，石蠟包埋，切成4 μm厚的石蠟切片，65℃烘烤，脫蠟，采用免疫組織化學(xué)染色SP 法測(cè)定NF-κB、MMP-9 的表達(dá)，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作，用已知陽性切片作為陽性對(duì)照，用PBS 代替一抗作為陰性對(duì)照:3%H2O237℃孵育10 min 滅活內(nèi)源性過氧化物酶，PBS 洗滌;微波修復(fù)抗原，PBS 洗滌;10%山羊血清封閉，室溫孵育10 min;用1∶50稀釋的NF-κB、MMP-9 多克隆抗體4℃過夜孵育，PBS 沖洗;加生物素標(biāo)記的抗人IgG 抗體室溫孵育30 min，PBS 沖洗;辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素室溫孵育30 min，PBS 沖洗;DAB 顯色;蘇木素染色，封片，光鏡觀察。

1.4 判定標(biāo)準(zhǔn)NF-κB、MMP-9 陽性染色判定標(biāo)準(zhǔn)為細(xì)胞質(zhì)(核)內(nèi)檢出棕黃色顆粒。隨機(jī)選取5 個(gè)有代表性的視野計(jì)數(shù)200 個(gè)細(xì)胞，若陽性細(xì)胞占同類細(xì)胞百分比＜10%為陰性。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 10.0 統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)比較各組間蛋白表達(dá)差異，相關(guān)性比較采用Spearman等級(jí)相關(guān)性分析，P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NF-κB、MMP-9 蛋白在CSES、CIN 及NCE 中的表達(dá)免疫組化結(jié)果顯示，NF-κB 蛋白主要定位于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中，MMP-9 蛋白主要定位于細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)中，呈線狀棕黃色顆粒。在CSES、CIN 及NCE 中，NF-κB 陽性表達(dá)率分別為72.5%(58/80)、18.6%(13/70)、0(0/50)，MMP-9 陽性表達(dá)率分別為68.8%(55/80)、15.7%(11/70)、0(0/50)，NF-κB、MMP-9 蛋白在CSES 的陽性表達(dá)率顯著高于CIN 和NCE，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05);NF-κB、MMP-9 在CIN 和NCE 中的表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)。見表1。

表1 不同宮頸組織NF-κB、MMP-9 蛋白表達(dá)的比較例(%)

2.2 NF-κB、MMP-9 表達(dá)與宮頸癌臨床病理特征的關(guān)系NFκB、MMP-9 的陽性表達(dá)與宮頸癌不同病理分級(jí)、臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況密切相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)，而與患者年齡和組織學(xué)類型無關(guān)(P ＞0.05)。見表2。

2.3 NF-κB、MMP-9 在宮頸癌中表達(dá)的相關(guān)性80 例宮頸癌組織中，NF-κB、MMP-9 表達(dá)呈明顯正相關(guān)(r =0.872，P ＜0.05)。見表3。

3 討論

NF-κB 是轉(zhuǎn)錄基因家族的重要成員，正常情況下與其抑制物I-κB 結(jié)合，在細(xì)胞質(zhì)中呈失活狀態(tài)。當(dāng)細(xì)胞受到刺激后，NF-κB 與I-κB 解離并易位到細(xì)胞核中，與相應(yīng)的靶序列結(jié)合，調(diào)控Bcl-2、c-myc、MMP-9 等基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，參與免疫和炎癥反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)，NF-κB 作為一種多向性、多功能核轉(zhuǎn)錄因子，在乳腺癌、肝癌、結(jié)腸癌等多種惡性腫瘤中過表達(dá)，通過調(diào)控細(xì)胞增殖在腫瘤的發(fā)生發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用［3］。

表2 NF-κB、MMP-9 表達(dá)與宮頸癌臨床病理特征的關(guān)系

表3 NF-κB、MMP-9 在宮頸癌中表達(dá)的相關(guān)性比較 例

多項(xiàng)研究表明，宮頸癌組織和細(xì)胞系中存在NF-κB 的活性上調(diào)［4，5］。本實(shí)驗(yàn)中我們采用免疫組化法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，NF-κB 蛋白在CSES 中的陽性表達(dá)率顯著高于CIN 和NCE(P ＜0.05)，提示NF-κB 的異常表達(dá)可能是宮頸癌發(fā)生發(fā)展的重要機(jī)制之一。有關(guān)NF-κB 在宮頸癌中的作用機(jī)制尚不十分清楚，目前研究顯示NF-κB 可能通過抑制細(xì)胞凋亡導(dǎo)致腫瘤發(fā)生，其可能機(jī)制有:(1)誘導(dǎo)凋亡抑制基因Bcl-2 的表達(dá)和活化;(2)誘導(dǎo)癌基因c-myc 的激活;(3)上調(diào)cyclinD1 的表達(dá)，促使細(xì)胞周期從G1/G0 期向S 期轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致細(xì)胞異常增殖。

MMP-9 是MMPs 家族的重要成員之一，參與細(xì)胞外基質(zhì)和血管壁基底膜的降解和破壞。研究發(fā)現(xiàn)MMP-9 在幾乎所有的惡性腫瘤組織中均表達(dá)增高，參與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移［6］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，MMP-9 蛋白在CSES 中的陽性表達(dá)率顯著高于CIN 和NCE(P ＜0.05)，提示MMP-9 的異常表達(dá)參與了宮頸癌的侵襲和轉(zhuǎn)移。研究發(fā)現(xiàn)在人類MMP-9 基因啟動(dòng)子區(qū)域存在NF-κB 等轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)，NF-κB 與其結(jié)合后可調(diào)控MMP-9 基因的轉(zhuǎn)錄。Yoonseo［7］采用南蛇藤素抑制NF-κB 的活性后能夠顯著抑制MMP-9 基因的表達(dá)，從而抑制乳腺癌細(xì)胞MCF-7 的侵襲和轉(zhuǎn)移。由此可見，腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移過程中至少有2 個(gè)或2 個(gè)以上基因的異常表達(dá)并相互配合，從而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生發(fā)展。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，NF-κB、MMP-9 的表達(dá)與患者年齡及病理類型無關(guān)，而與腫瘤組織分級(jí)、臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況密切相關(guān)，提示細(xì)胞惡變程度越高，分期越晚及發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移時(shí)，NF-κB、MMP-9 表達(dá)越顯著。由此看出，NF-κB 的激活通過調(diào)控其下游基因MMP-9 的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化和宮頸癌的侵襲轉(zhuǎn)移。

1 Aggarwal BB.Nuclear factor-kappa B:the enemy with in.Cancer Cell，2004，6:203-208.

2 李嬋玉，李力.MMP-9 及其相關(guān)因子與宮頸癌.重慶醫(yī)學(xué)，2012，41:3545-3547.

3 Qiao L，Yu J，Dent P，et al.NF-kappa B protects rat ARL-6 hepatocellular carcinoma cells against hydrogen peroxide induced apoptosis.Cancer Biol Ther，2005，4:1195-1202.

4 Du CX，Wang Y.Expression of P-Akt，NF-kappaB and their correlation with human papillomavirus infection in cervical carcinoma.Eur J Gynaecol Oncol，2012，33:274-277.

5 Li J，Jia H，Xie L，et al.Association of constitutive nuclear factor-kappaB activation with aggressive aspects and poor prognosis in cervical cancer.Int J Gynecol Cancer，2009，19:1421-1426.

6 Roomi MW，Monterrey JC，Kalinovsky T，et al.In vitro modulation of MMP-2 and MMP-9 in human cervical and ovarian cancer cell lines by cytokines，inducers and inhibitors.Oncol Rep，2010，23:605-614.

7 Yoonseo K.Celastrol inhibits breast cancer cell invasion via suppression of NF-κB-mediated matrix metalloproteinase-9 expression.Cell Physiol Biochem，2011，28:175-184.