黃天培，張 君，蘇新華，關(guān) 雄

(福建農(nóng)林大學(xué)生物農(nóng)藥與化學(xué)生物學(xué)教育部重點實驗室，福建福州 350002)

金屬污染物廣泛存在于環(huán)境之中，其中鉻是主要的金屬污染物之一［1，2］。尋求高效環(huán)保的含鉻廢水處理方案成為迫切需要解決的問題之一。廢水中的鉻存在形式主要有Cr(III)和Cr(VI)兩種，其中，以Cr(VI)的毒性最大，約是 Cr(III)的1000倍［3］。把Cr(VI)還原成Cr(III)是工業(yè)上處理含鉻廢水最常用的方法之一［4］。其中，微生物法處理含鉻廢水具有投資小、運(yùn)行費(fèi)用低、無二次污染等優(yōu)點［5］。目前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)對Cr(VI)具有較強(qiáng)解毒能力的微生物主要有假單胞菌(Pseudmonadaceae)、大腸桿菌(Escherichia coli)、陰溝腸桿菌(Enterobacter cloacae)和硫酸鹽還原菌(Sulfate-reducing bacteria)等［6-7］。微生物可以通過直接還原Cr(VI)、生成代謝產(chǎn)物來處理Cr(VI)和微生物吸附等方式達(dá)到解毒Cr(VI)的目的［8-12］。但是，微生物還原Cr(VI)在實際操作中仍然存在很多問題，如已報道能還原Cr(VI)微生物往往在造福人類的過程中對人類的健康產(chǎn)生威脅［13］。

蘇云金芽胞桿菌(Bacillus thuringiensis，簡稱Bt)是應(yīng)用廣泛的一種微生物農(nóng)藥，對環(huán)境安全、對人無致病性［13-14］。2005年 Sahin等人研究了 Bt對 Cr(VI)的動力學(xué)吸附過程［11］。2010年，本實驗室研究了不同來源(水樣、土壤、植物、動物、食品、昆蟲和飼料)Bt菌株還原鉻(VI)的情況，證明Bt菌株普遍具有將鉻(VI)還原為鉻(III)的能力，從中篩選出具有較強(qiáng)還原鉻(VI)能力的 Bt菌株［13］。因此，Bt是治理Cr(VI)污染的安全、高效候選材料之一。有鑒于此，以全基因組測序菌Bt 407為研究載體，將轉(zhuǎn)座子隨機(jī)突變載體pIC333轉(zhuǎn)化Bt 407，構(gòu)建轉(zhuǎn)座子隨機(jī)突變體庫，從中篩選出Cr(VI)還原突變株，確定了其中一株突變株的轉(zhuǎn)座子插入位點，并對突變株的作用機(jī)理進(jìn)行了初步探討，確認(rèn)了突變株主要通過增強(qiáng)還原能力來提高解毒Cr(VI)能力。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 Bt菌株407(法國農(nóng)科院Didier Lereclus教授實驗室惠贈)和大腸桿菌TG1(商業(yè)化菌株，本室保存)。

1.1.2 培養(yǎng)基 Luria-Bertani(LB)培養(yǎng)基:蛋白胨10 g，酵母粉 5 g，氯化鈉 10 g，蒸餾水 1 L，pH 7.0 ～7.2。

1.1.3 主要試劑 90 mg/L壯觀霉素水溶液、5 mg/mL紅霉素水溶液、4 mol/L氫氧化鈉、10000 mg/L Cr(VI)、1∶1 硫酸溶液、1∶1 磷酸溶液、2 mg/mL二苯碳酰二肼。

1.2 方法

1.2.1 Bt 407電擊感受態(tài)細(xì)胞的制備 參考Lecadet等人方法制備Bt 407電擊感受態(tài)細(xì)胞［15］。

1.2.2 轉(zhuǎn)座子隨機(jī)突變載體pIC333轉(zhuǎn)化Bt 407參考Lecadet等人方法電擊轉(zhuǎn)化pIC333(法國農(nóng)科院Didier Lereclus教授實驗室惠贈)至Bt 407［15］。參考孫長坡方法利用菌落PCR驗證轉(zhuǎn)化子:以M1(5'-GCATTAATGAATCGGCCAACG-3')和M2(5'-GTGGGTAAACCGTGAATATCG-3')為引物擴(kuò)增mini-Tn10轉(zhuǎn)座子壯觀霉素抗性基因;以ermF(5'-ATGAACGAGAAAAATATAAAACAC-3')和ermR(5'-TTACTTATTAAATAATTTATAGCTATT-3')為引物擴(kuò)增pIC333載體上的紅霉素抗性基因［16］。

1.2.3 Bt 407轉(zhuǎn)座子隨機(jī)插入突變體庫的構(gòu)建

參考孫長坡和Kamoun等人方法構(gòu)建Bt 407轉(zhuǎn)座子隨機(jī)插入突變體庫［16-17］。

1.2.4 Cr(VI)還原能力具有顯著差異的突變株篩選 通過Cr(VI)的測定檢測菌株對鉻的還原能力。以1%的接種量將菌液轉(zhuǎn)接于Cr(VI)濃度為50 mg/L的LB液體培養(yǎng)基中，以野生菌株Bt 407為對照，30℃培養(yǎng)24 h后測量菌液中剩余Cr(VI)的溶度。六價鉻的測定采用二苯碳酰二肼分光光度法［18］。

所有的實驗重復(fù)三次，在Excel中求標(biāo)準(zhǔn)差與方差。實驗結(jié)果經(jīng)數(shù)據(jù)分析，計算SEM和LSD。

1.2.5 轉(zhuǎn)座子插入位點側(cè)翼序列的分析 參考QIAGEN公司Gentra Purgene Yeast/Bact.Kit試劑盒進(jìn)行突變體的總DNA提取。利用Hind III完全酶切突變體總DNA。將酶切產(chǎn)物5μL純化后取5μL加入5μL Kit Ligation Mix，于 PCR 儀中16 ℃ 自連，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞TG1。利用引物e1(5'-CGTTGGCCGATTCATTAATGC-3')和 e3(5'-CGATATTCACGGTTTACCCAC-3')進(jìn)行mini-Tn10側(cè)翼序列的擴(kuò)增，并測序。通過BLAST分析序列同源性，確定轉(zhuǎn)座子插入位點。

1.2.6 Bt 407及其突變子的表型分析

1.2.6.1 生長曲線測定 將Bt 407及其14株突變子的甘油菌活化過夜，1%接種至100mL的LB中，30℃ 230 r/min震蕩培養(yǎng)，每隔1 h測定OD600，直至12 h。

1.2.6.2 Bt 407及其突變子對反應(yīng)液總鉻濃度的影響 以1%的接種量將菌液轉(zhuǎn)接于Cr(VI)濃度為50 mg/L的LB液體培養(yǎng)基中，以野生菌株Bt 407為對照，30℃培養(yǎng)24 h后測量反應(yīng)液中總鉻溶度?？傘t濃度采用高錳酸鉀高溫氧化及二苯碳酰二肼分光光度法于540 nm波長處測定［18-19］。所有的實驗重復(fù)三次，在Excel中求標(biāo)準(zhǔn)差與方差。實驗結(jié)果經(jīng)數(shù)據(jù)分析，計算SEM和LSD。

2 結(jié)果與分析

2.1 突變體庫的構(gòu)建

利用含有mini-Tn10轉(zhuǎn)座子的突變載體pIC333，構(gòu)建了Bt 407 Cry-隨機(jī)插入突變體庫，獲得了容量為1500個克隆的突變體庫，并通過抗性檢測和PCR分析對該庫進(jìn)行了鑒定。

2.1.1 抗性鑒定

構(gòu)建并優(yōu)化轉(zhuǎn)座子隨機(jī)突變技術(shù)平臺，將經(jīng)過高溫誘導(dǎo)突變的菌液涂布含有壯觀霉素和紅霉素LB平板，然后置于40℃培養(yǎng)。從該平板上挑取單克隆分別復(fù)制在相互對應(yīng)位置的壯觀霉素抗性平板和紅霉素抗性平板上，然后40℃培養(yǎng)，從抗性上鑒定突變株。其中不能在紅霉素平板上生長(圖1A)但能在壯觀霉素平板生長(圖1B)的克隆即有可能為突變株。

2.1.2 PCR 鑒定

隨機(jī)挑取數(shù)個突變子，以M1和M2為引物擴(kuò)增壯觀霉素抗性基因，以ermF和ermR為引物擴(kuò)增紅霉素抗性基因。含有載體pIC333的Bt 407轉(zhuǎn)化子可以擴(kuò)增到mini-Tn10轉(zhuǎn)座子和紅霉素抗性基因，而突變株可以擴(kuò)增到壯觀霉素，但擴(kuò)增不到紅霉素抗性基因(圖2)，從而構(gòu)建了一個容量為1500的Bt 407轉(zhuǎn)座子隨機(jī)突變體庫。

圖1 Bt 407突變體庫抗生素抗性檢驗Fig.1 Assay of Bt 407 mutant library by antibiotics

2.2 具有顯著Cr(VI)還原能力差異的突變株的篩選

在Bt 407轉(zhuǎn)座子隨機(jī)突變體庫中篩選具有Cr(VI)還原能力具有顯著差異的突變株，利用國家標(biāo)準(zhǔn)的六價鉻的測定(二苯碳酰二肼分光光度法)測定這些突變株還原50 mg/L Cr(VI)24 h后剩余的Cr(VI)濃度，重復(fù)三次，通過方差分析從中篩選出Cr(VI)還原能力與Bt 407野生株相比具有極顯著差異(P＜0.01)的突變株，共獲得14株(圖3)。野生株Bt 407在接種量為1%、溫度為30℃、Cr(VI)初始濃度為50 mg/L的條件下培養(yǎng)24 h后，將Cr(VI)的濃度降解至約22 mg/L，而這14株突變株在相同條件下可降解至低于2.5 mg/L，還原Cr(VI)的能力提高了9倍左右。

2.3 突變體Bt 407-Cr244轉(zhuǎn)座子插入位點側(cè)翼序列的克隆和序列分析

Bt 407基因組中含有許多Hind III位點，而mini-Tn10中不含有該位點。提取Bt 407-Cr244總DNA，將其基因組經(jīng)HindIII完全酶切為不同大小的片段(圖4A)。將酶切產(chǎn)物純化、自連、轉(zhuǎn)化大腸桿菌TG1。提取大腸桿菌TG1轉(zhuǎn)座子質(zhì)粒，并以e1/e3為引物擴(kuò)增得到mini-Tn10轉(zhuǎn)座子的側(cè)翼序列DNA片段，大小約為 2 kb(圖 4B)，說明 Bt 407-Cr244經(jīng)HindIII完全酶切后的自連產(chǎn)物已成功導(dǎo)入大腸桿菌TG1。以 e1/e3為引物，獲得 Bt 407-Cr244的 mini-Tn10側(cè)翼片段的核苷酸序列。對其進(jìn)行BLAST同源性比較，得出mini-Tn10轉(zhuǎn)座子插入位點與細(xì)胞色素氧化酶亞單位Ⅰ的核苷酸序列高度同源(圖5)。

圖2 Bt 407突變體庫PCR驗證Fig.2 Identification of Bt 407mutant strains by PCR

2.4 Bt 407及其突變子的表型分析

通過測定Bt 407及其突變子的生長曲線以及Cr(VI)還原過程中總鉻濃度來驗證14株突變株能力提高的可能原因。結(jié)果表明，Bt 407及其14株突變子的生長曲線十分相近，排除了菌株繁殖能力提高的原因(圖6)。在培養(yǎng)24小時后，Bt 407-Cr149和Bt 407-Cr285培養(yǎng)液中的總絡(luò)濃度比Bt 407極顯著降低(P＜0.01)，說明 Bt 407-Cr149和 Bt 407-Cr285在解毒Cr(VI)過程中除了還原作用，可能還具有生物吸附(圖7)。因此，突變株處理Cr(VI)能力提高的作用機(jī)理主要是還原能力增強(qiáng)，同時，極少數(shù)突變株的生物吸附作用得到加強(qiáng)。

圖3 具有顯著Cr(VI)還原能力差異的Bt 407突變株篩選Fig.3 Bt 407 mutants which Cr(VI)-reduction capacity were significantly different(P ＜0.01)from Bt 407

3 討論

自從1977年Romanenko等人首次報道脫色桿菌能夠在厭氧的條件下還原Cr(VI)開始［20］，越來越多的學(xué)者開始著手研究Cr(VI)還原菌。目前已發(fā)現(xiàn)多種不同的細(xì)菌能夠在好氧或厭氧的條件下將Cr(VI)還原成Cr(III)，包括蒼白桿菌、蠟狀芽孢桿菌、大腸桿菌、假單胞桿菌、脫硫弧菌、海藻希瓦氏菌和成團(tuán)泛菌等［21-22］。然而，利用細(xì)菌處理含鉻廢水仍存在一些缺陷:首先是所采用的細(xì)菌存在安全性的問題，菌種自身對人類或動物具有毒性;其次，因?qū)μ幚磉^程中的關(guān)鍵活性因子認(rèn)識不足，以致在實際應(yīng)用中細(xì)菌不能發(fā)揮其全部的還原Cr(VI)的能力［4］。而Bt對人類無致病性，不存在菌種安全性問題，并且可以高效還原Cr(VI)，是治理Cr(VI)污染的理想材料之一［13-14］。

圖4 突變體Bt 407-Cr244轉(zhuǎn)座子插入位點側(cè)翼序列的克隆Fig.4 Cloning flanking sequence of transposon insertion site in Bt 407-Cr244

國內(nèi)外研究主要集中于Cr(VI)還原菌的篩選與鑒定以及治理條件的優(yōu)化，對抗性和還原基因研究也較多。1983年，Lawrence等人從鉻廢水中分離出熒光假單胞菌LB300的質(zhì)粒，發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒pLHB1具有與Cr(VI)的抗性相關(guān)的基因［23］。1990年，Cervantes等人證明銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的鉻抗性為 ChrA決定［24］。2002年，Juhnke等人通過pMOL編碼的基因chrB1、chrC和chrI突變，驗證了決定鉻抗性的基因［25］。

圖5 Bt 407-Cr244轉(zhuǎn)座子插入位點分析Fig.5 Transposon insertion site in Bt 407-Cr244

圖6 Bt 407及其突變子的生長曲線Fig.6 Growth curves of Bt 407 and the mutants

目前，對Cr(VI)抗性或還原的調(diào)控基因研究還很少。2008年，Branco等人將Tn5轉(zhuǎn)座子隨機(jī)突變載體pSUP5011轉(zhuǎn)化蒼白桿菌5bvl1，鑒定了鉻抗性基因的轉(zhuǎn)座位點(TnOtChr)，驗證了其中的 chrB、chrA、chrC和chrF基因的功能，展示了一個關(guān)于鉻抗性操縱子的遺傳系統(tǒng)［26］。2009年，Henne等發(fā)現(xiàn)節(jié)桿菌FB24的基因組中包含著Cr(VI)抗性的決定因子(CRD)，由8個基因組成，包括抗性基因chrA和chrB。研究發(fā)現(xiàn)節(jié)桿菌Cr(VI)的抗性主要取決于ChrA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，新的基因在Cr(VI)的抗性中具有重要作用［27］。轉(zhuǎn)座子隨機(jī)插入突變技術(shù)作為轉(zhuǎn)座子組學(xué)研究的一個重要手段，既可以研究已知基因的新功能，也可以用來釣取調(diào)控特定性狀的新基因，是十分成熟的技術(shù)［28］。利用該技術(shù)得到還原Cr(VI)能力顯著提高的Bt 407突變株，并得到一個可能與調(diào)控Cr(VI)還原的基因為細(xì)胞色素氧化酶亞單位Ⅰ。細(xì)胞色素氧化酶亞單位Ⅰ是細(xì)胞色素氧化酶復(fù)合體組成單位之一，作為分子標(biāo)記在真核生物中廣泛應(yīng)用［29-30］。細(xì)胞色素氧化酶是線粒體和好氧性細(xì)菌的呼吸鏈終端酶，催化電子從細(xì)胞色素c分子氧的轉(zhuǎn)移，使分子氧被還原生成水，而電子被耦合到質(zhì)子轉(zhuǎn)運(yùn)過程中，穿過細(xì)胞膜，最后被F0F1-ATP酶利用來合成 ATP［31］，其對 Bt還原 Cr(VI)的影響機(jī)制至今未知。此外，通過對Bt 407及其突變子部分表型的研究進(jìn)一步確認(rèn)了突變株主要通過增強(qiáng)還原能力來提高解毒Cr(VI)能力。

圖7 在Bt 407及其突變子還原Cr(VI)過程中總鉻的測定Fig.7 Determination of total chromium during the process of Cr(VI)reduction with Bt 407 and its mutants

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