曹國珍，陸 棟，張苗苗，王菊芳，馬 良，李 欣，李文建*

(1.中國科學(xué)院近代物理研究所，甘肅蘭州 730000;2.蘭州大學(xué)藥學(xué)院，甘肅蘭州 730000)

釀酒酵母基因組的完整性經(jīng)常面臨著來自環(huán)境物質(zhì)導(dǎo)致的DNA損傷的挑戰(zhàn)，DNA損傷可引起釀酒酵母表型的突變，也可以造成受損基因在表達(dá)上的定量變化。然而，在長期的進(jìn)化過程中，釀酒酵母形成了完備 DNA損傷應(yīng)答(DNA damage response，DDR)體系，DDR由一系列對(duì)DNA損傷進(jìn)行識(shí)別、信號(hào)傳導(dǎo)和修復(fù)的蛋白組成［1］。一旦DNA損傷被機(jī)體感知，則發(fā)生以下效應(yīng):(1)通過停滯細(xì)胞周期來應(yīng)對(duì)DNA損傷，為DNA修復(fù)爭(zhēng)取時(shí)間;(2)通過信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)激活DDR體系;(3)通過誘導(dǎo)活性直接逆轉(zhuǎn)、切除損傷或?qū)NA損傷產(chǎn)生耐受［2，3］。如果損傷得不到有效的修復(fù)，則會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞程序性死亡。當(dāng)釀酒酵母DNA發(fā)生多種形式的損傷時(shí)，細(xì)胞就會(huì)啟動(dòng)相應(yīng)修復(fù)途徑，包括:同源重組修復(fù)(homologous recombination repair，HRR)、堿基錯(cuò)配修復(fù)(mismatch repair，MMR)、堿基切除修復(fù)(base excision repair，BER)以及核苷酸切除修復(fù)(nucleotide excision repair，NER)等。

重離子輻照對(duì)生物體的作用主要是通過能量沉積、質(zhì)量沉積以及動(dòng)量傳遞等過程實(shí)現(xiàn)的。由于其作用過程的復(fù)雜性決定了自身的特點(diǎn)，如:具有高的傳能線密度(linear energy transfer，LET)，從而使生物介質(zhì)產(chǎn)生高密度的電離和激發(fā)事件;在射程的末端有尖銳的能量損失峰，即Bragg峰;Bragg峰區(qū)域具有較高的相對(duì)生物學(xué)效應(yīng)(relative biological effectiveness，RBE);輻射效應(yīng)受組織中的含氧量影響很小，即氧增比(oxygen enhancement ratio，OER)低;輻射敏感性受細(xì)胞周期的影響較小;與生物介質(zhì)作用時(shí)具有較大的損傷截面;產(chǎn)生的DNA損傷是非隨機(jī)分布的成簇?fù)p傷(clustered damage，CD)等。由于重離子輻照的眾多特點(diǎn)，使之一直是輻射研究的熱點(diǎn)問題。當(dāng)重離子輻照釀酒酵母時(shí)，其關(guān)鍵靶分子DNA將發(fā)生各種形式的損傷;具體包括:DNA單鏈斷裂(single-strand break，SSB)、雙 鏈 斷 裂 (double-strand break，DSB)、堿基插入或丟失以及DNA氧化損傷等單位點(diǎn)損傷，同時(shí)也伴隨單位點(diǎn)損傷的復(fù)合，即成簇?fù)p傷。一般來講單位點(diǎn)損傷相對(duì)容易修復(fù)，成簇?fù)p傷的修復(fù)涉及到眾多環(huán)節(jié)，多是幾種修復(fù)機(jī)制的結(jié)合，對(duì)于這類損傷，修復(fù)系統(tǒng)往往不能兼顧且容易出現(xiàn)差錯(cuò)，再者修復(fù)酶也會(huì)因重離子輻照導(dǎo)致部分失活，從而不能完全激活修復(fù)系統(tǒng)。所以重離子輻照誘導(dǎo)的成簇?fù)p傷對(duì)釀酒酵母的影響較大。對(duì)于這類損傷，釀酒酵母中主要發(fā)揮修復(fù)作用的是HRR、MMR和BER途徑，這三條途徑相互協(xié)調(diào)、相互配合，形成龐大的監(jiān)控網(wǎng)絡(luò)，共同發(fā)揮對(duì)相應(yīng)損傷的修復(fù)作用，從而在重離子輻照的環(huán)境下維持基因組的穩(wěn)定性［4］。

1 HRR途徑

重離子輻照對(duì)釀酒酵母的直接損傷引起DNA的鏈斷裂，包括DSB和SSB，其中最為嚴(yán)重的生物學(xué)后果是DSB。對(duì)于DNA的鏈斷裂，主要由HRR途徑進(jìn)行修復(fù)，HRR是在多個(gè)蛋白分子或蛋白復(fù)合體嚴(yán)格有序的調(diào)控下運(yùn)行的［5］。像BER和NER途徑多發(fā)生在DNA復(fù)制之前，統(tǒng)稱為復(fù)制前修復(fù)(pre-replication repair);然而，當(dāng)DNA開始復(fù)制時(shí)還未修復(fù)的損傷部位也可以先復(fù)制后修復(fù)，但這樣會(huì)影響復(fù)制酶系的作用，結(jié)果子鏈DNA在損傷對(duì)應(yīng)處留下缺口，這種子代DNA遺傳信息的缺損可以通過遺傳重組加以彌補(bǔ)，即從同源DNA的母鏈上將相應(yīng)核苷酸序列移至子鏈缺口處，然后通過新合成的序列來填補(bǔ)母鏈的空缺，此過程就是HRR，因多發(fā)生在復(fù)制之后，故稱為復(fù)制后修復(fù)(post-replication repair)［6］。

1.1 HRR途徑的基本機(jī)制

HRR的分子機(jī)制最早在大腸桿菌(E.coli)和酵母(S.cerevisiae)中被闡明，在哺乳動(dòng)物中高度保守。在真核生物基因組中，大量的重復(fù)序列為DSB通過非等位基因的重復(fù)序列之間進(jìn)行HRR提供了充足的機(jī)會(huì)。HRR途徑修復(fù)DSB時(shí)，需要在受損DNA和未受損DNA之間存在相同序列，以未受損DNA分子作為模板，其中首選是姐妹染色單體，然后利用同源重組對(duì)DSB進(jìn)行修復(fù)。HRR的過程為:(1)DNA損傷位點(diǎn)的加工［7］;MRE11/RAD50/NXS2(MRN)三元復(fù)合物中的MRE11對(duì)DNA斷裂末端進(jìn)行5'→3'方向的切割，使3'單鏈DNA末端充分暴露，然后與RAD52結(jié)合。RAD52是一個(gè)大分子七聚體，可以保護(hù)伸出的DNA末端不被降解，再與復(fù)制蛋白A(replication protein A，RPA)分子結(jié)合，形成穩(wěn)定的單鏈前體物［8］。(2)鏈侵入和修復(fù)性合成;在此階段發(fā)揮重要作用的是HRR核心蛋白R(shí)AD51，在它的催化作用下，進(jìn)行同源序列的尋找、鏈配對(duì)以及鏈交換等過程，RAD51與3'單鏈DNA上的RPA分子結(jié)合形成復(fù)合物，為Holliday聯(lián)結(jié)(Holliday junction)的形成做準(zhǔn)備［9］。(3)Holliday聯(lián)結(jié)的形成與解離;上述復(fù)合物識(shí)別同源DNA模板并催化DNA鏈的配對(duì)、延伸，形成Holliday聯(lián)結(jié)，完成鏈交換過程，然后Holliday聯(lián)結(jié)經(jīng)核酸酶切割以后，再由連接酶連接，從而使Holliday聯(lián)結(jié)解體，得到完整的雙鏈 DNA 分子［7，9］(如圖1)。第二個(gè)損傷鏈可以由二次重組來修復(fù)，也可以以被替換的受體鏈為模版合成新的互補(bǔ)鏈。

圖1 釀酒酵母DNA同源重組修復(fù)過程Fig.1 The process of DNA homologous recombination repair in Saccharomyces cerevisiaes

1.2 HRR途徑相關(guān)蛋白

Rad52上位顯相組(epistasis groups)包括Rad50-57、Rad59、Mre11和 Xrs2共11個(gè)基因，其中保守性最高的是Rad51和Rad54，Mre11、Rad52和Rad50的主要序列中也存在保守區(qū)域。Rad52上位顯相組基因主要序列的保守性表明對(duì)應(yīng)蛋白的功能也具有保守性。釀酒酵母中，Rad52上位顯相組基因在DNA的DSB修復(fù)及遺傳重組過程發(fā)揮著重要作用，HRR途徑也主要依賴于這類基因。

RAD51作為HRR中的核心蛋白，對(duì)于它的研究最為廣泛，它在鏈侵入和修復(fù)性合成過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。RAD52、RAD54、RAD55、RAD57 及 RPA 能促進(jìn)RAD51的鏈交換活性，其中RAD55、RAD57與RAD51的氨基酸序列具有較高的相似性，故稱RAD55與RAD57為RAD51的同系物，RAD51與其同系物RAD55和RAD57形成雜合二聚體，該二聚體具有保守的ATP結(jié)合域和催化ATP水解的能力，從而可以促進(jìn)RAD51發(fā)揮鏈轉(zhuǎn)移功能，但RAD55及RAD57蛋白質(zhì)均不表現(xiàn)出自身相互作用［10］。RAD51除了可以介導(dǎo)鏈侵入和修復(fù)性合成以外，還對(duì)于電離輻照等引起的DNA雙鏈斷裂在得不到適當(dāng)修復(fù)時(shí)導(dǎo)致的染色體移位有抑制作用。MANTHEY G M等［11］研究認(rèn)為RAD51作為DNA雙鏈斷裂修復(fù)所必需的蛋白，可以介導(dǎo)解離重復(fù)序列的基因轉(zhuǎn)化，也可以通過單鏈退火效應(yīng)抑制染色體轉(zhuǎn)位的形成;這說明RAD51可以通過抑制染色體移位來減輕或消除DNA雙鍵斷裂帶來的損傷。另外，RAD51與腫瘤相關(guān)基因具有一定的作用，它表達(dá)水平的失調(diào)可導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，因而對(duì)于RAD51的研究還具有重要的臨床意義。如杜利清等［12］研究發(fā)現(xiàn)RAD51蛋白在人體骨肉瘤組織肌細(xì)胞中高表達(dá)，然而這種高表達(dá)極有可能參與了骨肉瘤的化療抵抗。不僅在HRR中Rad52上位顯相組發(fā)揮著重要作用，而且非同源重組也主要由它來調(diào)控。釀酒酵母中，Mre11、Rad50和Xrs2突變使得非同源重組途徑對(duì)DSB的修復(fù)能力較野生型釀酒酵母明顯降低，這一過程不受 Rad51、Rad52、Rad54和 Rad57突變的影響［13］，這就說明 MRE11/RAD50/XRS2蛋白復(fù)合物同時(shí)在同源重組和非同源重組中都起重要作用。

HRR過程中，介導(dǎo)DSB修復(fù)的蛋白也參與無損傷的正常細(xì)胞生命活動(dòng)中所發(fā)生的DNA重組。因此，DSB修復(fù)缺陷不僅造成對(duì)DNA損傷劑的敏感，而且影響正常生物機(jī)能，如會(huì)影響有絲分裂的重組、接合型轉(zhuǎn)換及抗原受體基因的重排等［14］，因而對(duì)DNA重組及DSB修復(fù)的研究具有重要的實(shí)際意義。

非同源末端連接(non-homologous end joining，NHEJ)在重離子輻照導(dǎo)致的DSB的修復(fù)中也發(fā)揮著重要作用。由于NHEJ不需要同源序列，只需要蛋白-DNA復(fù)合體把DNA末端連接起來，因而NHEJ可發(fā)生在整個(gè)細(xì)胞周期中［15］，而HRR需要同源DNA模板的存在，所以主要發(fā)生在姐妹染色單體已經(jīng)形成的S期和G2期。至于選擇NHEJ還是HRR修復(fù)DSB，除了取決于細(xì)胞所處的周期外，還取決于損傷產(chǎn)生的DNA末端以及主要參與NHEJ和HR的兩種蛋白Ku70/80和RAD52在DNA末端的結(jié)合能力［16］。一般認(rèn)為高等真核生物中DSB的修復(fù)是以NHEJ起主導(dǎo)作用的，而對(duì)于釀酒酵母這樣較為低等的真核生物則主要依靠HRR，而NHEJ相對(duì)較少，故不再詳細(xì)介紹。

2 MMR途徑

DNA在復(fù)制過程中出現(xiàn)的序列錯(cuò)誤主要來自兩方面:一是DNA復(fù)制時(shí)插入若干個(gè)與模板堿基不配對(duì)的核苷酸;二是外界環(huán)境因素，如重離子輻射等造成的序列錯(cuò)誤。在正常細(xì)胞分裂時(shí)，堿基配對(duì)出現(xiàn)錯(cuò)誤的概率僅約為 1/1010-1/109［17］，而在外界刺激作用下，出錯(cuò)幾率明顯提高，這對(duì)生物體的正常生命活動(dòng)極為不利。MMR是一個(gè)從細(xì)菌到真核生物皆保守的DNA修復(fù)途徑，它能夠修復(fù)各種因素所導(dǎo)致的DNA堿基錯(cuò)配、片段插入或缺失、環(huán)形成等形式的DNA損傷以及DNA的結(jié)構(gòu)異常，使DNA整體復(fù)制的保真度增加50-1000倍，從而維持生物體基因組結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、降低基因突變、增強(qiáng)抵抗不良環(huán)境因素的能力。另外，MMR也被認(rèn)為是BER途徑的一個(gè)重要的候補(bǔ)修復(fù)途徑［18］。

2.1 MMR途徑的基本機(jī)制

MMR途徑是在一系列相關(guān)蛋白的嚴(yán)格調(diào)控下對(duì)錯(cuò)配DNA進(jìn)行修復(fù)，基本過程如下:(1)損傷位點(diǎn)的識(shí)別;MutS蛋白是MMR途徑的識(shí)別成分，它首先辨認(rèn)錯(cuò)配或未配對(duì)堿基并與之結(jié)合，然后在MutL參與下形成MutL-MutS-DNA復(fù)合物，同時(shí)增強(qiáng)MutSDNA復(fù)合體的穩(wěn)定性［19］。(2)錯(cuò)配位點(diǎn)的剪切;MutL-MutS-DNA復(fù)合體激活核酸內(nèi)切酶的活性，在錯(cuò)配位點(diǎn)附近對(duì)新合成的一股DNA鏈進(jìn)行切割，然后在DNA解旋酶和單鏈DNA結(jié)合蛋白(SSS)的共同作用下使單鏈DNA被核酸外切酶將錯(cuò)配位點(diǎn)整段切除［20，22］。(3)DNA 修復(fù)合成;在 DNA 聚合酶Ⅲ及DNA連接酶的作用下，根據(jù)模板鏈的序列，填補(bǔ)新鏈被切除的部分，包括錯(cuò)配或未配對(duì)的堿基，從而完成整個(gè)錯(cuò)配修復(fù)過程(如圖2)。由于切口與錯(cuò)配核苷酸相距較遠(yuǎn)，故這種修復(fù)系統(tǒng)是一種長片段修復(fù)(long-patch repair)，在整個(gè)過程中，錯(cuò)配的核苷酸只是其堿基與母鏈在配對(duì)上出現(xiàn)了問題，而核苷酸的基本結(jié)構(gòu)是正確的，因此只需對(duì)錯(cuò)配堿基進(jìn)行切除后再重新配對(duì)即可［21，22］。

2.2 MMR途徑相關(guān)蛋白

圖2 釀酒酵母DNA錯(cuò)配修復(fù)過程Fig.2 The process of DNA mismatch repair in Saccharomyces cerevisiaes

MMR是在多種蛋白相互協(xié)調(diào)和配合下進(jìn)行的。在大腸桿菌中，MMR途徑包括 MutS、MutL和 MutH修復(fù)蛋白，稱作MutHSL系統(tǒng)。該系統(tǒng)主要依賴于MutS、MutL、MutH、4 個(gè)核酸外切酶、SSB、DNA 解旋酶Ⅱ、DNA聚合酶Ⅲ和DNA連接酶在內(nèi)的11個(gè)相關(guān)蛋白［23］。在釀酒酵母中，MMR途徑和大腸桿菌的MutHSL系統(tǒng)極為類似，具有相似的機(jī)制和同源的關(guān)鍵蛋白。在釀酒酵母的MMR系統(tǒng)中，發(fā)揮重要作用的蛋白有6個(gè) MutS同源物，分別為:MSH1、MSH2、MSH3、MSH4、MSH5、MSH6，4 個(gè) MutL 同源物分別為:PMS1，MLH1，MLH2，MLH3，但 MutH 同源物還沒有在釀酒酵母中發(fā)現(xiàn)［24］。其中MSH1在線粒體錯(cuò)配修復(fù)中發(fā)揮關(guān)鍵作用，維持線粒體DNA復(fù)制的高保真度［25］。MSH2識(shí)別配錯(cuò)堿基并與相應(yīng)序列結(jié)合形成MSH2-DNA復(fù)合物，從而啟動(dòng)修復(fù)過程，該復(fù)合物再與MLH1和PMS1所形成的異二聚體結(jié)合形成四聚體，引發(fā)錯(cuò)誤核苷酸的切除。MSH3除了能與MSH2形成二聚體，在錯(cuò)配修復(fù)過程中起識(shí)別作用外，還具有維持簡(jiǎn)單重復(fù)序列穩(wěn)定性的作用。盡管MSH4和MSH5是MutS的同源基因，但并不參與錯(cuò)配修復(fù)活動(dòng)，而是參與減數(shù)分裂重組事件。當(dāng)有錯(cuò)配發(fā)生時(shí)，MSH2分別于 MSH6、MSH3結(jié)合形成Mutsα和 Mutsβ復(fù)合物，MSH4和 MSH5結(jié)合形成Mutsr復(fù)合物。其中，Mutsα復(fù)合物的主要作用是修復(fù)單堿基和大片段的插入/缺失;Mutsβ復(fù)合物的主要功能是修復(fù)插入/錯(cuò)配環(huán)。Mutsα復(fù)合物具有ATP酶的活性，這對(duì)于它修復(fù)錯(cuò)配DNA是必須的，ATP水解作用表現(xiàn)出對(duì)于MutS二聚體、DNA和其他蛋白之間相互作用的調(diào)節(jié)能力。ANTONY E等［26］在對(duì)于MutS二聚體是如何利用ATP的研究中發(fā)現(xiàn)MSH6類似于S1亞基，快速水解ATP，而MSH2類似于S2亞基，對(duì)ATP的水解較慢。MLH1可以和PMS2、PMS1、MLH3形成 Mutlα、Mutlβ 和 Mutlr復(fù)合物，這些復(fù)合物具有識(shí)別配錯(cuò)堿基，插入或刪除片段的修復(fù)以及避免突變的功能。與原核生物不同的是MutS和MutL均為異源二聚體，因此真核生物的MMR過程中鏈的識(shí)別和缺口的產(chǎn)生與原核生物有所不同。

在龐大的蛋白體系中，不同的損傷形式所需的蛋白種類也有所差異。STONE J E等［24］研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)于堿基配錯(cuò)和單個(gè)堿基的插入或刪除的修復(fù)主要需要 MSH2、MSH6、MLH1、PMS1 復(fù)合物，而 MSH3、MSH4、MSH5、MLH2、MLH3 卻不是必需要的;對(duì)于由1-14堿基形成小環(huán)而造成的損傷主要由MSH2、MSH3、MLH1、PMS1 復(fù)合物修復(fù)，而 Mutlβ 和 Muls在DNA移碼突變修復(fù)中作用很小。

還有一些其他參與MMR的相關(guān)物質(zhì)，如核酸內(nèi)切酶(除了核酸外切酶Ⅰ)、復(fù)制蛋白、復(fù)制因子和DNA聚合酶Ⅲ、DNA連接酶、單鏈結(jié)合蛋白等已經(jīng)被證實(shí)，但是否還包含一些像DNA解旋酶Ⅱ和除了核酸外切酶Ⅰ以外的其他核酸酶還不太清楚［23］。同時(shí)還有一些新的成果不斷出現(xiàn)，如鐘天映等［27］通過建立易錯(cuò)PCR隨機(jī)突變的方法對(duì)MutS進(jìn)行功能研究，發(fā)現(xiàn)了新的功能位點(diǎn)A272，該位點(diǎn)在MutS結(jié)合錯(cuò)配DNA時(shí)起著重要的作用，為MutS的功能與結(jié)構(gòu)研究提供了新的信息。

總之，在重離子束輻照釀酒酵母造成DNA堿基插入、丟失或錯(cuò)配的損傷修復(fù)中，MMR增強(qiáng)DNA復(fù)制的忠實(shí)性，降低自發(fā)突變率，誘導(dǎo)DNA損傷細(xì)胞凋亡而消除由突變細(xì)胞可能帶來的不良后果，防止了錯(cuò)誤累積從而維持基因組的穩(wěn)定性，保障基因組復(fù)制的高精確性等方面的意義是不言而喻的。

3 BER途徑

由于重離子輻照對(duì)釀酒酵母的間接生物學(xué)效應(yīng)，引起DNA氧化損傷，該類損傷的修復(fù)主要由BER 途徑來完成［28，29］。一般情況下，氧化 DNA 損傷會(huì)產(chǎn)生 AP位點(diǎn)(apurinic/apyrimidinic sites，AP位點(diǎn))，AP位點(diǎn)的產(chǎn)生有兩種方式，一種是通過N-糖苷鍵的自發(fā)水解作用而形成;另一種是通過DNA N-糖基化酶切除損傷或不適合位點(diǎn)而形成的。這類損傷會(huì)潛在的引起DNA復(fù)制和轉(zhuǎn)錄過程的突變，更嚴(yán)重的會(huì)導(dǎo)致致死性損傷的發(fā)生，因而會(huì)影響基因組的穩(wěn)定性。另外，COOKE M S等［30］研究發(fā)現(xiàn)，與細(xì)胞核DNA(nDNA)相比，線粒體DNA(mtDNA)具有更高的不穩(wěn)定性和氧化損傷敏感性，BER途徑對(duì)nDNA和mtDNA損傷都有效。

3.1 BER途徑的基本機(jī)制

盡管在釀酒酵母和哺乳動(dòng)物細(xì)胞中BER過程很相似，但還是存在一些顯著的不同，作為真核生物，它們?cè)谝恍┫嚓P(guān)修復(fù)蛋白上存在著很高同源性。真核生物BER的機(jī)制為:(1)發(fā)生變化的堿基從脫氧核糖-磷酸鹽鏈上水解下來，形成AP位點(diǎn);在這個(gè)過程中，需要DNA糖苷酶的催化作用，這些只具有切割功能的糖苷酶即為單功能糖苷酶，還有一些DNA糖苷酶除了可以促進(jìn)N-糖苷鍵的斷裂，還具有AP裂解酶的活性，有利于DNA骨架的斷裂，這些DNA糖苷酶即為雙功能糖苷酶［28］。(2)在AP核酸內(nèi)切酶(AP Endonuclease，APE)的作用下，識(shí)別和切除 AP位點(diǎn);由于APE的作用使得脫氧核苷酸鏈發(fā)生單鏈斷裂(SSB)而產(chǎn)生5'-脫氧核糖核酸(5'-dRP)末端。(3)通過DNA聚合酶β激活5'-dRP酶從而使5'-dRP釋放出來，或者是在交叉DNA單鏈內(nèi)切酶FEN1的切除作用下使5-dRP釋放出來，結(jié)果產(chǎn)生了一個(gè)或多個(gè)核苷酸缺口。(4)這些缺口通過DNA聚合酶的作用而填充，同時(shí)一連串的DNA鏈通過DNA連接酶而連接起來;在這個(gè)過程中DNA聚合酶β的作用十分重要，陳月琴等［31］研究發(fā)現(xiàn)DNA聚合酶β的162位發(fā)生 Val→Ala突變，使得 DNA聚合酶 β在BER中的能力顯著減弱，充分說明DNA聚合酶β在BER中具有重要的作用。

在釀酒酵母中，首先AP位點(diǎn)也可以通過APE識(shí)別和切除，隨后在分叉DNA單鏈內(nèi)切酶RAD27的作用下切除5'-dRP形成核苷酸缺口，緊接著是DNA聚合酶β對(duì)DNA的修復(fù)合成以及CDC2對(duì)缺口的連接步驟［32］。由于釀酒酵母缺乏擁有AP裂解酶活性的DNA聚合酶，故在此階段，3種DNA N-糖基化酶賦予了AP裂解酶的活性，這3種糖基化酶分別是NTG1、NTG2和OGG1，這些AP裂解酶也可以識(shí)別和切除AP位點(diǎn)，使磷酸二酯鍵發(fā)生單鏈斷裂而產(chǎn)生3'-脫氧核糖核酸(3'-dRP)末端，從而進(jìn)入修復(fù)過程的下一步，它們主要參與了氧化DNA損傷的修復(fù)過程(如圖3)。

圖3 釀酒酵母中AP位點(diǎn)的堿基切除修復(fù)［36］Fig.3 Base excision repair of AP sites in Saccharomyces cerevisiaes

3.2 BER途徑的相關(guān)蛋白

在釀酒酵母中，APE是BER途徑的限速酶，它由APE1和APE2兩個(gè)異構(gòu)體組成［33］。APE1和 APE2分別是由基因APN1和APN2編碼，而在線粒體中，主要是由基因APN1編碼的APE1蛋白發(fā)揮作用［34］。DNA N-糖基化酶NTG1、NTG2和OGG1具有AP裂解酶的活性，這些酶是釀酒酵母所特有的。RAD27作為哺乳動(dòng)物細(xì)胞中交叉DNA單鏈內(nèi)切酶FEN1的同源物，在5'-dRP的切除形成核苷酸缺口的過程中發(fā)揮著重要的作用。

3.2.1 AP 核酸內(nèi)切酶 APNl和 APN2 APN1 是由Apn1基因編碼的，該基因位于釀酒酵母的Ⅺ染色體上，處于 Rad27基因的下游［32］。APN1是由367個(gè)氨基酸組成的單分子酶，其分子量約為41.4 kDa，包含了3個(gè)鋅原子，鋅原子的存在對(duì)于該酶的催化活性具有決定性的作用。另外，VONGSAMPHANH R等［35］研究發(fā)現(xiàn)APN1在轉(zhuǎn)移到線粒體的過程中需要APN1與PIR1相互作用。APN1具有多個(gè)催化活性［36］:(1)具有AP核酸內(nèi)切酶的活性，該活性作用是在突變產(chǎn)生的AP位點(diǎn)的5'端切開DNA鏈;(2)具有3'-磷酸二酯酶的活性，其作用是切除3'-dRP末端;(3)具有核酸內(nèi)切酶的活性，作用是在5'-端切除氧化作用造成的DNA堿基損傷。因此，APNl是一個(gè)功能強(qiáng)大的酶，它具有多重活性，可以保護(hù)細(xì)胞核和線粒體免受由于內(nèi)源性、外源性氧化和烷化劑對(duì)DNA的損傷。

APN2是哺乳動(dòng)物細(xì)胞APE1的同源物，Apn2基因位于釀酒酵母的Ⅱ染色體上，對(duì)應(yīng)的APN2蛋白是由520個(gè)氨基酸組成的蛋白，其分子量為59.4 kDa;APN2具有雙重作用［37］:(1)催化 AP位點(diǎn)在5-端水解磷酸二酯骨架，由單鏈的斷裂而產(chǎn)生3'-羥基和3'-dRP，這個(gè)作用和APN1相似。(2)具有3'到5'核酸外切酶的活性，可以切除多個(gè)核苷酸。

3.2.2 AP裂解酶NTG1、NTG2和OGG1 在釀酒酵母中，存在著3種AP裂解酶，分別是NTG1、NTG2和OGG1，它們的作用是主要修復(fù)由于氧化作用造成的DNA損傷。Ntg1、Ntg2、Ogg1基因分別位于Ⅰ、XIV和XIII染色體上，編碼的蛋白的分子量大約都為40 kDa左右。Ntg1和Ogg1同時(shí)存在于細(xì)胞核和線粒體中，而Ntg2主要是在細(xì)胞核中，它們的作用是在AP位點(diǎn)的3'端切除磷酸二酯骨架，從而產(chǎn)生3'-dRP末端，在APN1蛋白缺乏的釀酒酵母細(xì)胞中，AP裂解酶NTG1、NTG2和OGG1的作用顯得更為重要。YOU H J等［38］研究表明 Ntg1、Ntg2、Ogg1 基因同時(shí)缺失的菌株，DNA對(duì)于烷化劑的敏感程度比Apn1基因單缺失菌株更加強(qiáng)，這說明AP位點(diǎn)的大量累積在Ntg1、Ntg2、Ogg1基因缺失菌株中得不到有效地清除。張遵真等［39］在對(duì)OGG1的研究中發(fā)現(xiàn)，在眾多的DNA氧化損傷中，8-羥基鳥嘌呤(8-oxoguanine，8-oxoG)形成頻率最高、致突變性最強(qiáng)，可導(dǎo)致G:C→T:A顛換，體內(nèi)特異性識(shí)別8-oxoG并將其切除修復(fù)的酶就是OGG1。因此，NTG1、NTG2和OGG1發(fā)揮的AP裂解酶的作用對(duì)于釀酒酵母清除AP位點(diǎn)十分有利，特別是對(duì)于APN1缺乏和APN1和APN2同時(shí)缺乏的細(xì)胞顯得尤為明顯。

3.2.3 分叉DNA單鏈內(nèi)切酶RAD27 在釀酒酵母BER途徑中，AP位點(diǎn)主要是通過APN1識(shí)別和切除的，這樣往往產(chǎn)生單鏈斷裂的5'-dRP末端，在隨后的5'-dRP催化切除中需要哺乳動(dòng)物細(xì)胞FEN1的同源物RAD27核酸內(nèi)切酶的作用。RAD27是一種結(jié)構(gòu)特殊的分叉DNA單鏈內(nèi)切酶，它屬于RAD2核酸酶家族成員，該類酶都具有5'到3'核酸外切酶的活性［40］。RAD27可以修復(fù)1個(gè)到5個(gè)核苷酸缺口，WU X等［32］研究發(fā)現(xiàn)在Rad27基因敲除的情況下，細(xì)胞對(duì)烷化劑的致死性效應(yīng)十分的敏感。另外，由于在Apn1基因敲除的細(xì)胞中，AP位點(diǎn)主要是通過由AP裂解酶NTG1、NTG2和 OGG1切除的，所以對(duì)于Apn1基因敲除的細(xì)胞而言，分叉DNA單鏈內(nèi)切酶RAD27對(duì)AP位點(diǎn)的切除并不是必需的。

4 討論與展望

從生物學(xué)角度來講，生理程序化DNA損傷和這些損傷序列對(duì)于多基因的表達(dá)調(diào)控是必要的［41］。然而，非生理程序化DNA損傷會(huì)干涉基因轉(zhuǎn)錄進(jìn)程，進(jìn)而影響正常的生命活動(dòng)。因此，對(duì)于DNA損傷修復(fù)的研究十分重要，在某種意義上它決定著生命基本活動(dòng)的完成［42］。

釀酒酵母作為真核模式生物，以單細(xì)胞形式存在，遺傳物質(zhì)包裹在細(xì)胞膜中，以細(xì)胞核DNA和質(zhì)粒DNA形式存在。當(dāng)重離子輻照時(shí)，注入離子通過直接或間接作用誘導(dǎo)遺傳物質(zhì)發(fā)生突變，注入離子的動(dòng)量傳遞產(chǎn)生對(duì)細(xì)胞的直接作用，能量沉積則表現(xiàn)出對(duì)細(xì)胞的間接作用［43］。直接作用導(dǎo)致DNA發(fā)生鏈斷裂，主要由HRR途徑來修復(fù);同時(shí)，重離子輻照產(chǎn)生大量的活性氧自由基(reactive oxygen species，ROS)所介導(dǎo)的間接作用對(duì)DNA造成氧化、堿基插入或缺失以及AP位點(diǎn)的形成等損傷［44］，主要由MMR和BER途徑發(fā)揮修復(fù)作用。嚴(yán)格來講，由于重離子輻照機(jī)制的復(fù)雜性和作用的多樣性使得DNA損傷也多式多樣，一般情況下，多種損傷形式處于并存狀態(tài)，并且各個(gè)修復(fù)途徑對(duì)于DNA損傷形式并沒有嚴(yán)格的界定，因此在釀酒酵母遭受重離子照射時(shí)，HRR、MMR和BER途徑聯(lián)合啟動(dòng)，在多種蛋白質(zhì)參與下，形成廣泛而高效的網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，共同發(fā)揮DNA損傷修復(fù)作用。

由于生命本身的復(fù)雜性決定了DNA修復(fù)機(jī)制的多樣性，使DNA損傷、修復(fù)與基因轉(zhuǎn)錄之間存在著復(fù)雜的關(guān)系，并且由于DNA損傷對(duì)基因轉(zhuǎn)錄的間接影響使這種關(guān)系更加復(fù)雜化。因此，對(duì)DNA損傷修復(fù)的研究還有很多機(jī)理不甚明了。例如，作為基因的載體，染色體在DNA的修復(fù)中扮演者重要的角色，在過去的研究中，學(xué)者們認(rèn)為在DNA修復(fù)中染色體先要被展開，然后又要還原，似乎阻礙了DNA修復(fù)的進(jìn)行，然而GASTON S等［45］最近的研究表明染色體的相關(guān)組件也能積極地促進(jìn)DNA損傷的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和修復(fù)。另外，與原核生物相比，釀酒酵母基因的復(fù)雜性給DNA損傷修復(fù)網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)的研究帶來新的挑戰(zhàn)，所以對(duì)它的認(rèn)識(shí)是一個(gè)逐漸深入的過程。

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