趙永珍， 張 慜*， 陳志雄

（1.江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無錫 214122；2.廣東嘉豪食品股份有限公司，廣東 中山528447）

雞肉香味鮮美，風(fēng)味怡人，深受人們的喜愛。為此，人們希望能給一些食品賦予雞肉香味，由此促進(jìn)了人們對(duì)雞肉香精的研究。雞汁調(diào)味料是以磨碎的雞肉和雞骨或其濃縮提取物以及其他輔料等為原料，添加或不添加香辛料和（或）食用香料等增香劑加工而成，具有雞的濃郁鮮味和香味的汁狀復(fù)合調(diào)味料。熱反應(yīng)產(chǎn)生的雞肉香精由于香氣強(qiáng)烈、逼真度高、抗氧化性好受到研究人員的重視。近年來，國(guó)外對(duì)熱反應(yīng)雞肉香精的研究較為活躍，而國(guó)內(nèi)在這方面的研究還相對(duì)薄弱和滯后，到目前為止，關(guān)于如何生產(chǎn)雞肉香精的有關(guān)信息還較少[1]。

水解蛋白由于富含氨基酸、氨基酸鈉鹽與多肽，其通?？勺鳛轷r味料或通過與還原糖發(fā)生美拉德反應(yīng)制備熱加工肉類香精。Spanier的研究表明：多肽在牛肉加工、水解植物蛋白、烤可可與咖啡的風(fēng)味形成過程中起著非常重要的作用，不同的多肽序列作為前體物質(zhì)將產(chǎn)生不同的食品風(fēng)味。因此，當(dāng)通過美拉德褐變生產(chǎn)特定風(fēng)味化合物時(shí)，水解蛋白的游離氨基酸的組成與含量、相對(duì)分子質(zhì)量分布、多肽的組成及化學(xué)構(gòu)型等對(duì)美拉德反應(yīng)中形成的風(fēng)味物質(zhì)的種類等具有非常重要的影響[2-3]。

目前肉味香精發(fā)展于近30年，其主流是酶解技術(shù)用于水解氮源物質(zhì)，用水解動(dòng)物蛋白（HAP）、水解植物蛋白（HVP）作為肉味香料的前體物，再配合以氨基酸、酵母膏、還原糖和脂肪等物質(zhì)，經(jīng)美拉德反應(yīng)形成香氣濃郁圓潤(rùn)、口感醇厚逼真的肉味香精[4]。

作者以雞骨架為底物，通過酶法水解制備雞骨架蛋白水解物，作為Maillard的反應(yīng)物，用以對(duì)不同水解度的酶解產(chǎn)物對(duì)美拉德產(chǎn)物風(fēng)味形成的影響進(jìn)行探討。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

凍藏雞骨架：購于無錫市濱湖區(qū)歐尚超市；Flavourzyme風(fēng)味蛋白酶，Protamex復(fù)合蛋白酶，木瓜蛋白酶，Novozym37071酶：廣州明耀商貿(mào)有限公司提供。

1.2 主要儀器與設(shè)備

恒溫水浴鍋，立式高壓蒸汽滅菌鍋，精密酸度計(jì)，絞肉機(jī)，消化爐，改良式凱氏定氮裝置，電子天平，冷凍離心機(jī)，馬弗爐，電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱。

1.3 測(cè)定方法

1.3.1 酶解工藝的研究方法

1）酶的選擇實(shí)驗(yàn)：采用風(fēng)味蛋白酶和復(fù)合蛋白酶（F：P），風(fēng)味蛋白酶和木瓜蛋白酶（F：PP）以及風(fēng)味蛋白酶和Novozym37071酶 （F：N）3種不同復(fù)配酶進(jìn)行水解，對(duì)酶解液的水解度及感官進(jìn)行比較，選擇最佳復(fù)配酶。復(fù)配酶的兩種酶質(zhì)量比為1∶1，酶用量為0.4%，料液質(zhì)量體積比為1 g∶2 mL，在各自的適宜水解條件下水解。

酶適宜作用條件根據(jù)酶生產(chǎn)廠家提供的資料和預(yù)試驗(yàn)確定：風(fēng)味蛋白酶和復(fù)合蛋白酶適宜溫度為55℃，pH為6.0；，風(fēng)味蛋白酶和木瓜蛋白酶的適宜溫度 55 ℃，pH 6.5； 料液比 1 g∶2 mL，Novozym 37071酶和風(fēng)味蛋白酶的適宜溫度55℃，pH為6.5。

2）酶配比的選擇：用以上所確定的最佳酶組合，選擇不同的雙酶組合比例，以水解度和蛋白質(zhì)回收率為考察指標(biāo)，選擇最優(yōu)配比。

3）酶用量的選擇：選定料液比為 1 g∶2 mL，水解時(shí)間3 h，酶用量0.2%～1.0%，pH值6.8，水解時(shí)間3 h，測(cè)定其DH，確定最適酶用量。

4）料液比的選擇：選定pH 值6.8、溫度55℃、上述確定的酶用量料液質(zhì)量體積比分別在1 g∶1 mL～1 g∶5 mL 條件下水解 3 h，分別測(cè)定其 DH，確定最佳料液比。

5）酶解溫度的選擇：選定水解時(shí)間3 h，pH值6.8，上述確定的酶用量，料液質(zhì)量體積比，分別在45～65℃條件下水解，分別測(cè)定D H，確定最適酶解溫度。

6）酶解pH值的選擇：選定水解時(shí)間3 h，上述所確定的酶用量、溫度，及料液質(zhì)量體積比，pH值為5.5～7.5，分別測(cè)定其DH，確定其最適pH值。

7）酶解時(shí)間的選擇：按選定的最佳參數(shù)，酶解時(shí)間分別為1～7 h測(cè)定其水解度，確定最佳酶解時(shí)間。

8）最佳工藝條件的確定：根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)論，選擇酶解溫度、時(shí)間、pH值、加酶量4因素，每因素三水平設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，其因素水平設(shè)計(jì)見表1。取 L9（34）正交表，做正交試驗(yàn)。

表1 復(fù)合蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶的酶解正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal test of enzymolysis condition byFlavourzyme andProtamex

1.3.2 雞骨架酶解的工藝流程 雞骨架→預(yù)處理→高溫蒸煮（120℃，1 h）→粉碎→加去離子水→調(diào)節(jié)pH值→加酶恒溫水解→100℃滅酶15 min→4 800 r/min離心20 min→過濾→雞骨架水解蛋白液。

1.3.3 檢驗(yàn)方法 蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測(cè)定：凱氏定氮法：GB/T5009.5-2003；水解度的測(cè)定：參照參考文獻(xiàn)[5]

氨基酸態(tài)氮的測(cè)定：甲醛滴定法，參照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T5009.39-2003。蛋白質(zhì)利用率的測(cè)定：按以下公式計(jì)算。

蛋白質(zhì)利用率=（酶解上清液中總氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)/原料中總氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)）×100%

產(chǎn)品感官品評(píng)[6]：就樣品的嗅感、口味、色澤、外觀等方面評(píng)價(jià)產(chǎn)品的質(zhì)量，各指標(biāo)按很弱 （----）、弱（---）、較弱（--）、稍弱（-）、一般/不存在（0/×）、稍 好 （+）、較 好 （++）、好 （+++）、很 好（++++），由5人組成感官評(píng)價(jià)小組，對(duì)不同工藝的產(chǎn)品進(jìn)行對(duì)比鑒評(píng)，根據(jù)可接受性進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。

2 結(jié)果與討論

2.1 原料的預(yù)處理

首先是對(duì)凍藏的雞架進(jìn)行解凍，然后對(duì)原料進(jìn)行清洗、去雜，特別是雞架，還有一些內(nèi)臟殘留物要去除；另外是汆湯，主要目的是去血去異味，因?yàn)檠鄱己胁煌男任?，如果直接蒸煮，?huì)使湯液帶腥且混濁，影響風(fēng)味及色澤，所以必須經(jīng)過汆燙，讓殘留的血凝固，經(jīng)過沖洗后以除去血及一些異味且經(jīng)過汆湯后所得雞湯較清澈。在工業(yè)化生產(chǎn)中不能像傳統(tǒng)方法那樣，邊熬煮邊撇去浮沫，可將粉碎后的骨頭用冷水浸泡20 min是骨頭中的血液滲透到水中，這樣就可以把浮沫的問題解決好[7]。

另外，為了增加骨內(nèi)含物與水的交流，有必要對(duì)骨頭適當(dāng)破碎和加壓處理，便于呈味物質(zhì)的溶出。利用高壓處理可分解膠原蛋白為可溶性水解物，讓人們?nèi)菀孜者@些小分子營(yíng)養(yǎng)物，且高壓把骨渣充分預(yù)處理，骨頭變酥更易于酶與底物的接觸，酶解主要作用于肌肉纖維中的蛋白和部分已經(jīng)溶出的膠原蛋白，這樣可以提高原料的利用率。作者采用120℃蒸煮1 h，時(shí)間小于1 h時(shí)尚有骨頭沒有充分變酥，大于1 h時(shí)，蒸煮液的蒸煮味嚴(yán)重，故選擇1 h為宜。

2.2 酶的選擇

2.2.1 酶的種類選擇 酶法水解的動(dòng)物蛋白有一定的苦味，NEYKH[8]等曾研究表明蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物的苦味和蛋白質(zhì)的疏水性值有關(guān)。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)疏水值較大時(shí)，用不含端肽酶的蛋白酶水解就會(huì)產(chǎn)生較強(qiáng)的苦味?？辔峨牡亩嘶酁槭杷被幔绻猛馇忻盖谐祟愂杷被?，游離出的疏水氨基酸與原苦味肽相比苦味要低的多。風(fēng)味蛋白酶既是內(nèi)切酶也是外切酶，因此風(fēng)味蛋白酶在一定程度上能有效脫苦。所以采用木瓜蛋白酶、復(fù)合蛋白酶以及Novozym37071酶這3種內(nèi)切蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶按質(zhì)量比1∶1復(fù)配后，在各自適宜的條件下對(duì)雞骨蛋白的酶解效果進(jìn)行比較。結(jié)果如圖1。

圖1 不同酶對(duì)水解度影響Fig.1 Effect of enzyme on degree of hydrolysis

表2 F∶P酶解不時(shí)間對(duì)感官指標(biāo)的影響Table 2 Effects of enzymolysis time onSensory indexes by Flavourzyme and Protamex

表3 F∶PP酶解不同時(shí)間對(duì)感官指標(biāo)的影響Table 3 Effects of enzymolysis time onSensory indexes by Flavourzyme and Papain

表4 F∶N酶解不同時(shí)間對(duì)感官指標(biāo)的影響Table 4 Effects of enzymolysis time onSensory indexesby Flavourzyme andNovozym37071

通過比較發(fā)現(xiàn)利用風(fēng)味蛋白酶和復(fù)合蛋白酶復(fù)配進(jìn)行酶解所得的酶解液水解度最高，且總體風(fēng)味最好，故以下實(shí)驗(yàn)采用風(fēng)味蛋白酶和復(fù)合蛋白酶復(fù)配酶解制取雞骨蛋白酶解液。

2.2.2 酶的配比選擇 由圖2可知，當(dāng)風(fēng)味蛋白酶用量逐漸增多，復(fù)合蛋白酶所占比例變小時(shí)，水解度不斷增加，而蛋白質(zhì)的利用率卻在減小。在比例為1∶2時(shí)，水解度與蛋白質(zhì)回收率相對(duì)較高。因此，從酶解效果和經(jīng)濟(jì)角度考慮，復(fù)合蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶的酶配比為1∶2時(shí)為最佳方案。有關(guān)酶解的研究表明，復(fù)合蛋白酶的內(nèi)肽酶較強(qiáng)，總體的水解力較強(qiáng)，但水解程度不夠徹底；而風(fēng)味蛋白酶的端肽酶較強(qiáng)，能更徹底地將蛋白質(zhì)和肽水解成為氨基酸，這可能是導(dǎo)致當(dāng)風(fēng)味蛋白酶的比例增加時(shí)水解度增加而蛋白質(zhì)利用率下降的原因[9]。

圖2 復(fù)合蛋白酶與風(fēng)味蛋白酶的配比對(duì)水解度及蛋白質(zhì)回收率的影響Fig.2 Effect of ratioof Flavourzyme and Protamex on degree of hydrolysis and Protein recovery

2.3 單因素結(jié)果分析

2.3.1 酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)的選擇 當(dāng)料液比一定，增加的酶量又未使底物濃度飽和時(shí)，加酶量越大，反應(yīng)速度也越快，蛋白質(zhì)的水解度也越高。但當(dāng)繼續(xù)增加加酶量，生產(chǎn)成本也相應(yīng)提高，同時(shí)，也有可能導(dǎo)致酶自身相互水解，使酶活力降低，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。由圖3可知，水解度隨加酶量的增大而增加，但加酶量大于質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.8%時(shí)，酶解度增加減緩，考慮到生產(chǎn)成本問題，選擇加酶量0.8%較為合適。

圖3 加酶量對(duì)水解度的影響Fig.3 Effect of enzyme dosage on degree of hydrolysis

2.3.2 料液比的選擇 料液比對(duì)水解反應(yīng)效果有影響，主要是因?yàn)榱弦嘿|(zhì)量體積比的變化會(huì)引起酶反應(yīng)體系中底物和酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化。由圖4可知，隨著料液質(zhì)量體積比的增加，水解度不斷增加。而實(shí)際生產(chǎn)中，水分過多，濃度則越稀，作為商品，仍需要濃縮，耗能大。綜合考慮，確定料液質(zhì)量體積比為 1 g∶2 mL。

圖4 料液比對(duì)水解度的影響Fig.4 Effect of solid liquid ratio on degree of hydrolysis

2.3.3 酶解溫度的選擇 由圖5可知，在一定的溫度范圍內(nèi)隨著反應(yīng)溫度的升高，水解度不斷增加但超過一定溫度后，水解度會(huì)隨著溫度的升高而降低。這是因?yàn)樵谝欢ǚ秶鷥?nèi)升高溫度，反應(yīng)速度加快，酶解效率也相應(yīng)提高，但溫度過高，酶蛋白變性，酶的穩(wěn)定性下降，酶解效率隨之降低。所以，最適溫度為55℃。

2.3.4 酶解pH值的選擇 pH值影響酶的穩(wěn)定性，所以pH值對(duì)水解反應(yīng)影響很大。各種酶都有各自的最適pH值范圍，由圖6可知，pH 6.5左右時(shí)，水解度最大，所以復(fù)合蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶復(fù)合的最適pH值取6.5。

圖5 溫度對(duì)水解度的影響Fig.5 Effects of temperature on degree of hydrolysis

圖6 pH對(duì)水解度的影響Fig.6 Effects of pH on degree of hydrolysis

2.3.5 酶解時(shí)間的選擇 由圖7可知，隨著時(shí)間的增加，水解度不斷增加，當(dāng)增加到一定程度，時(shí)間為3 h的時(shí)候，增加的速度開始變慢，綜合考慮效率及成本的問題，單因素水解時(shí)間最優(yōu)選4 h。

圖7 酶解時(shí)間對(duì)水解度的影響Fig.7 Effects of enzymolysis time on degree of hydrolysis

2.4 最佳工藝條件的確定

通過酶解單因素試驗(yàn)選擇最佳的條件，根據(jù)L9（34）正交表對(duì)其進(jìn)行正交試驗(yàn)優(yōu)化，結(jié)果見表5，趨勢(shì)圖見圖8。由表5和圖8可以看出，各因素影響的主次關(guān)系為D＞C＞B＞A即酶用量>酶解時(shí)間>酶解溫度>酶解pH。各因素的最優(yōu)水平組合為D3C3B2A2即酶用量為8‰，酶解溫度為55℃，酶解時(shí)間為5 h，酶解pH值為6.5。

表5 酶解正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果Table 5 Design and resultsoforthogonaltestfor enzymolysis

圖8 酶解正交試驗(yàn)因素趨勢(shì)圖Fig.8 Statistic curve oforthogonalfactorsduring enzymolysis

3 結(jié)語

作者通過對(duì)不同種類的酶水解所得的酶解液的感官品評(píng)及水解度的比較，篩選出最佳的酶組合為復(fù)合蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶，當(dāng)兩者以1∶2的質(zhì)量比復(fù)配時(shí)，蛋白質(zhì)回收率及水解度都相對(duì)較高。并在一系列的單因素基礎(chǔ)上，以水解度為特征指標(biāo)，通過4因素3水平正交實(shí)驗(yàn)對(duì)復(fù)合蛋白酶與風(fēng)味蛋白酶的復(fù)配水解雞骨架工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，得出最佳酶解工藝條件為溫度55℃，pH值6.5，加酶量0.8%，水解時(shí)間5 h。此時(shí)酶水解雞骨泥的水解度為23.69%。在后續(xù)的研究中，可以在以上優(yōu)化條件下改變水解時(shí)間，獲得不同相對(duì)分子質(zhì)量的多肽和氨基酸的酶解液，以研究不同水解度的蛋白質(zhì)水解液對(duì)美拉德反應(yīng)的影響。

[1]黃師榮，宋煥祿.熱反應(yīng)雞肉香精的制備研究[J].北京工商大學(xué)學(xué)報(bào)，2001，19（3）：9-10.HUANG Shi-rong，SONG Huan-lu.Sudy on production of chicken essence by Maillardrection [J].Journal of Beijing Technology and Business University，2001，19（3）：9-10.（in Chinese）

[2]M Qi，N S Hettiarachychy，U Kalapathy.Solubility and emulsifying properties of soyproteinisolatesmodifiedbypancreatin[J].J Food Sci，1997，62（6）：1110-1114.

[3]ZHANG Yuan-gang，B Dorjpalam，Chi-Tang Ho.Contribution of peptidestovolatile for mation in the maillar dreaction of Caseinhy droly sate with glucose[J].J Agric Food Chem，1992，40：2467-2471.

[4]朱凱，王玉.蛋白水解制備肉味香精的研究概況[J].化學(xué)工業(yè)與工程技術(shù)，2007，28（6）：1-4.ZHU Kai，WANG YU.Research situation of meat flavor usingprotein hydrolysis[J].Chemical Industry and Engineering Technology，2007，28（6）：1-4.（in Chinese）

[5]盧曉蕊，歐陽杰，魯軍，等.采用二次回歸法確定雞肉蛋白酶法水解條件[J].生產(chǎn)與科研經(jīng)驗(yàn)，2007，33（7）：85-86.LU Xiao-rui，OUYANG Jie，LU Jun，et al.Using quadratic regression method to determine the enzymatic hydrolysis conditions of the chicken protein[J].Production and Scientific Research Experience，2007，33（7）：85-86.（in Chinese）

[6]蔡鳳英，王金水，史軍，等.雞肉蛋白酶解物制備天然調(diào)味基料的研究[J].食品工業(yè)科技，2007，28（8）：191-192.CAI Feng-ying，WANG Jin-shui，JUN Shi，et al.Study on producing natural flavoring using chicken proteasesolution[J].Science and Technology of Food Industry，2007，28（8）：191-192.（in Chinese）

[7]呂永林，張留安.骨類高湯應(yīng)用問題的產(chǎn)生機(jī)理及解決措施探討[J].肉類工業(yè)，2008，331（11）：25-26.LV Yong-ling，ZHENG Liu-an.Discussingthemechanism and solvingmeasures of the problem happening in the application of bone stock[J].Meat Industry，2008，331（11）：25-26.（in Chinese）

[8]NEY K H.Hydrolysis of deliberated proteins[J].J Food Sci，2002，24（3）：87-89.

[9]趙霞，馬儷珍.酶解利用骨蛋白的研究進(jìn)展[J].肉類工業(yè)，2003，28（6）：32-36.ZHAO Xia，MA Li-zhen.Research progress of bone proteinusing enzyme[J].Meat Industry，2003，28（6）：32-36.（in Chinese）