蔣長興， 焦云鵬， 熊清平， 陳曉明， 王紀(jì)忠， 曾曉雄

（1.淮陰工學(xué)院 生命科學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院，江蘇 淮安 223003；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科技學(xué)院，江蘇 南京210095；3.江蘇食品職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇 淮安 223003）

多糖是生物體內(nèi)廣泛存在的一類大分子物質(zhì)，一些天然多糖已被證實具有抗腫瘤、抗病毒、抗感染、抗氧化、增強(qiáng)免疫力等多種生物學(xué)功能[1]。多糖的這些生物學(xué)功能與其自身的理化性質(zhì)、空間結(jié)構(gòu)、取代基的類型等方面密切相關(guān)[2]。較多研究表明，海蜆多糖具有抗腫瘤、增強(qiáng)免疫力、抗感染等生理功能[3]。然而到目前為止有關(guān)海蜆多糖的分離純化、理化性質(zhì)及活性等方面的研究報道不多。采用離子交換柱層析 （DEAE-纖維素）與凝膠柱層析（Sephadex G-100）法，將海蜆多糖進(jìn)行分離純化，獲得不同純化組分；測定粗多糖及其純化組分的總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)、蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)、糖醛酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)、硫酸基質(zhì)量分?jǐn)?shù)，以及相對分子質(zhì)量及純度，測定粗多糖及純化產(chǎn)品的還原力、金屬離子螯合能力、還原能力、脂質(zhì)過氧化抑制活性等，對海蜆多糖及純化組分的抗氧化活性進(jìn)行體外評價。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮海蜆：南京惠民橋水產(chǎn)品批發(fā)市場提供；DEAE-纖維素、葡聚糖G-100、葡萄糖醛酸、葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品：購于Sigma公司；考馬斯亮藍(lán)G-250、氯化鋇、明膠、三氯乙酸、三氟乙酸等：均為分析純試劑。

1.2 儀器與設(shè)備

可見分光光度計：721型，上海菁華科技儀器有限公司產(chǎn)品；電子天平：AY-120型、BL-220H型，日本SHIMADZU公司產(chǎn)品；電腦全自動部份收集器：DBS-100A型，上海滬西分析儀器廠產(chǎn)品；氣相色譜儀：Agilent 6890N型，美國Agilent公司產(chǎn)品；高效液相色譜儀：Agilent 1100 Series型，美國Agilent公司產(chǎn)品；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：Laborota-400型，Heidolph公司產(chǎn)品。

1.3 方法

1.3.1 提取制備 鮮活海蜆清洗干凈，暫養(yǎng)過夜。去殼，取肉、體積分?jǐn)?shù)75%乙醇保存。2 d后將肉勻漿，向勻漿中加入體積分?jǐn)?shù)75%乙醇保存4周，以脫去海蜆勻漿中的脂肪、色素及其它雜物。離心，烘干，得海蜆組織粉。稱取海蜆組織粉適量，加入一定體積的蒸餾水，水浴提取、離心、抽濾、濃縮、體積分?jǐn)?shù)75%乙醇沉淀、烘干得多糖粗提物。Sevag法脫蛋白，得粗多糖，備用。

1.3.2 分離純化 海蜆多糖DEAE-纖維素層析柱的分離與葡聚糖凝膠柱層析法進(jìn)一步純化參照Qiao等[4]報道的方法并稍作修改。稱取60 mg海蜆多糖溶于3 mL去離子水中，加樣于DEAE-纖維素層析柱（2.6 cm×30 cm）中，用不同濃度的NaCl溶液依次洗脫，洗脫液流速設(shè)為1.0 mL/min，自動部分收集器分步收集（10 min/管）不同濃度洗脫液對應(yīng)的流出液。硫酸-苯酚法檢測各管流出液的多糖含量（490 nm處吸收值），將較大吸光值對應(yīng)的流出液合并收集，合并液50℃條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，，透析24 h，經(jīng)真空冷凍干燥，獲得初步純化產(chǎn)品。稱取20 mg經(jīng)DEAE-纖維素初步純化的多糖組分，溶于5 mL去離子水中，加樣于Sephadex G-100凝膠層析柱（2.6 cm×60 cm）。用去離子水洗脫，洗脫速度為0.25 mL/min，自動部分收集器分步收集流出液（5 min/管）。硫酸-苯酚法檢測各管中流出液的多糖含量（490 nm處吸收值），將較大吸光值對應(yīng)的流出液合并收集，合并液于50℃條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，自來水和去離子水分別透析24 h，最后將透析液真空冷凍干燥，得到純化產(chǎn)品。

1.3.3 理化性質(zhì)測定 樣品中總糖、蛋白質(zhì)、糖醛酸硫酸基質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測定，參照Dubois等[5]、Bradford[6]、Blumenkrantz 等[7]、Dodgson 等[8]等 報 道 的方法。樣品的純度和相對分子質(zhì)量測定，參照Roy等[9]報道的分子排阻高效液相色譜法。將已知相對分子質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)多糖用流動相配成1.0 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液，經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后，采用Agilent 1100 series高效液相色譜儀、TSK-Gel G3000 SWXL色譜柱、示差檢測器（RID）進(jìn)行分析。流動相為含0.1 mol/L Na2SO4的0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 6.8），流動相流速為0.8 mL/min，色譜柱和檢測器溫度均為25℃，進(jìn)樣體積為20 μL，記錄示差色譜圖的保留時間（TR）。繪制多糖分子量的標(biāo)準(zhǔn)曲線。稱取多糖樣品配制1.0 mg/mL溶液，相同條件下進(jìn)行高效液相色譜分析。

1.3.4 體外抗氧化活性

1）金屬螯合能力的測定 金屬離子螯合能力的測定參照Liu等[10]報道的方法。取不同濃度的樣品（CP、F1、F2和 F3）溶液 1.0 mL 于試管中，分別加入0.05 mL氯化亞鐵溶液（2.0 mmol/L）、0.2 mL菲洛嗪（ferrozine）溶液（5.0 mmol/L）、2.75 mL 去離子水。 混勻反應(yīng)體系，10 min后分光光度法測定562 nm處吸光值。設(shè)EDTA-2Na為實驗對照。金屬離子螯合能力按照下面公式進(jìn)行計算：螯合率（%）=（A對照-（A樣品-A干擾））/A對照×100%。

2）還原力的測定 還原力測定參照Oyaizu等[11]報道的方法。配制不同濃度的待測試樣1.0 mL，分別加入1.0 mL磷酸鹽緩沖液（0.2 mol/L，pH=6.6）和1.0 mL 鐵氰化鉀[K3Fe（CN）6]溶液（1%）。50 ℃水浴20 min，迅速冷卻，加入三氯乙酸（質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%）1.0 mL，離心（5 000 r/min，15 min）。 取上清液 1.5 mL，依次加入 1.5 mL H2O，0.3 mL FeCl3溶液（質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%），混勻，700 nm處測定吸光值，得A1。以0.3 mL H2O代替FeCl3溶液（質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%），測得A2。設(shè)Vc為實驗對照。還原力為A700nm=（A樣品-A干擾）。

3）脂質(zhì)過氧化抑制活性的測定 脂質(zhì)過氧化抑制活性的測定采用硫代巴比妥酸反應(yīng)底物（TBARS）法[12]。取不同濃度的多糖溶液 1.0 mL，依次加入1.0 mL的質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的小鼠肝臟勻漿 （每100 mL的勻漿含有1 g的小鼠肝臟）、0.05 mL的0.5 mmol/L FeCl2溶液、0.05 mL的 0.5 mmol/L H2O2溶液，混合物37℃反應(yīng)60 min后，再加入1.5 mL的TCA溶液（質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%）、1.5 mL TBA溶液（質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.8%），所得混合液100℃反應(yīng) 15 min，4 000 r/min離心10 min后，分光光度法測定上清液在532 nm處的吸光值，設(shè)Vc為實驗對照。抑制率（%）= （A對照-（A樣品-A干擾））/A對照×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 海蜆多糖分離純化

采用DEAE-纖維素柱層析法，以不同濃度NaCl溶液（0、0.1、0.5 mol/L）作為洗脫液對海蜆粗多糖進(jìn)行初步分離，得到3個主要組分，分別標(biāo)記為F1、F2、F3（圖 1）。 將這 3 個組分分別收集，50 ℃減壓蒸發(fā)濃縮，濃縮液去離子水透析48 h，透析液真空冷凍干燥，得到初步純化產(chǎn)品。利用Sephadex G-100層析柱對經(jīng)DEAE-纖維素色譜柱初步分離的3個組分進(jìn)行純化處理，得到3個純化組分（圖1）。分別記為 f1、f2和 f3。

2.2 海蜆多糖基本性質(zhì)

圖1 海蜆多糖DE-52（a）與葡聚糖G-100（b）柱層析洗脫曲線Fig.1 Stepwise elution curve of CP on anion-exchange chromatography column of DEAE-52 cellulose（A）and elution curve of polysaccharide fractions（F1，F(xiàn)2and F3）from DEAE-52 cellulose on sizeexclusion chromatography column of Sephadex G-100 （B）

海蜆多糖基本化學(xué)組成測定顯示：海蜆粗多糖總糖、蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為83.81%、3.08%。表明海蜆經(jīng)過熱水提、醇沉等工藝所得的產(chǎn)品多糖為主要成分。由于海蜆多糖屬于動物性多糖，含有一定量的糖蛋白，采用Sevag法只能除去游離蛋白質(zhì)，因此海蜆粗多糖的蛋白質(zhì)可能是結(jié)合的糖蛋白。海蜆多糖純化組分f1、f2、f3總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為98.75%、95.58%、84.71%，f3蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 6.34%，f1、f2蛋白質(zhì)未能檢出。表明f1、f2為單一的不含蛋白的多糖組分，而f3含有一定量結(jié)合的糖蛋白。海蜆粗多糖通過DEAE-纖維素與Sephdex G-100凝膠柱層析法分離純化所得到的各個組分總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)、純度均大大提高，并且能夠?qū)⒑薪Y(jié)合蛋白的組分與其他多糖組分進(jìn)行有效地分離。

由糖醛酸、硫酸基質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定結(jié)果可以看出，海蜆多糖糖醛酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為1.58%、0.16%、0.96%、2.13%，硫酸基質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.92%、1.22%、2.08%、3.58%。表明海蜆多糖均含有不等量的糖醛酸、硫酸基等帶電基團(tuán)，隨著NaCl濃度的提高，所得到的純化組分糖醛酸、硫酸基含量逐漸提高。該結(jié)論證實f2、f3為含有糖醛酸、硫酸基的酸性多糖組分。f1含有一定量的糖醛酸與硫酸基，與f2、f3相比，含量均較低，因此可以認(rèn)為f1是一種中性多糖。

2.3 海蜆多糖的純度及相對分子質(zhì)量

海蜆多糖分子排阻高效液相圖譜表明f1、f2、f33組分在高效液相圖譜上的保留時間分別為8.423、8.140、7.750 min，將保留時間代入回歸方程，計算得到各組分的平均相對分子質(zhì)量。f1、f2、f3的平均相對分子質(zhì)量分別為 68 600、80 600、100 600。

2.4 體外抗氧化活性

2.4.1 金屬離子的螯合能力 海蜆多糖對金屬離子螯合能力的測定結(jié)果見圖2。由圖2可以看出，海蜆多糖具有一定金屬離子的螯合能力。多糖濃度對金屬離子的螯合能力影響極顯著（P＜0.01）。隨著多糖質(zhì)量濃度提高，金屬離子的螯合能力呈上升趨勢。對CP來說，當(dāng)多糖質(zhì)量濃度在0～3.2 mg/mL的范圍內(nèi)時，金屬離子的螯合能力隨著多糖質(zhì)量濃度的提高呈較顯著的上升趨勢；當(dāng)多糖質(zhì)量濃度在3.2～4.0 mg/mL的范圍內(nèi)時，金屬離子的螯合能力隨著多糖質(zhì)量濃度的提高上升趨勢不顯著 （P＞0.05）。對 f3、f2、f1來說， 在實驗設(shè)計的范圍內(nèi) （0～4.0 mg/mL），金屬離子的螯合能力隨著多糖質(zhì)量濃度的提高呈較顯著的上升趨勢。在實驗設(shè)計的范圍內(nèi)（0～4.0 mg/mL），海蜆多糖的金屬離子的螯合能力由小到大的順序為 F1＜F2＜F3＜CP。 多糖質(zhì)量濃度為 4.0 mg/mL 時，CP、F1、F2、F3的金屬離子的螯合能力分別為95.1%、57.7%、63.5%、86.3%。由以上分析知，海蜆多糖高質(zhì)量濃度時對金屬離子的螯合能力較強(qiáng)。有報道稱，化合物中如果含有-OH、-SH、-COOH、-PO3H2、C=、-NH2、-S-、-O-等基團(tuán)就有可能具有一定的金屬離子螯合能力[13]。海蜆多糖中的對金屬離子的螯合能力可能是由于其分子鏈中含有的大量羥基、羧基等活性基團(tuán)。

圖2 海蜆粗多糖及純化組分的金屬離子螯合能力Fig.2 Chelating effects and reducing power of CP，F(xiàn)1，F(xiàn)2 and F3

2.4.2 海蜆多糖的還原力 海蜆多糖還原力的測試結(jié)果見圖3。由圖3可以看出，海蜆多糖具有一定還原能力。多糖濃度對還原力影響達(dá)到顯著水平（P＜0.05）。隨著多糖質(zhì)量濃度提高，還原力呈上升趨勢。在實驗設(shè)計的范圍內(nèi)（0～4.0 mg/mL），海蜆多糖的還原力由小到大的順序為 CP＜F1＜F2＜F3。 多糖質(zhì)量濃度為 4.0 mg/mL 時，CP、F1、F2、F3還原力分別為41.6%、42.9%、43.4%、59.6%。在實驗設(shè)計的范圍內(nèi)（0～4.0 mg/mL），海蜆多糖的還原力均顯著低于Vc，表明海蜆多糖具有中等強(qiáng)度的還原力。

圖3 海蜆粗多糖及純化組分的金屬離子螯合能力Fig.3 Chelating effects and reducing power of CP，F(xiàn)1，F(xiàn)2 and F3

2.4.3 海蜆多糖的脂質(zhì)過氧化抑制活性 脂質(zhì)過氧化是生物體內(nèi)氧自由基參與的不飽和脂肪酸自動氧化反應(yīng)。生物體內(nèi)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)一方面破壞了細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的完整性，另一方面生成了具有潛在的細(xì)胞毒性脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物。脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物通常是丙二醛（MDA），該物質(zhì)的生成量是衡量生物體內(nèi)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)程度的重要指標(biāo)[14]。MDA能與硫代巴比妥酸發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，生成一種粉紅色物質(zhì)，該物質(zhì)在波長532 nm處呈最大吸收。在多糖的脂質(zhì)過氧化抑制活性測試中，通過采用分光光度法測定反應(yīng)體系532 nm處吸光值的變化來確定多糖脂質(zhì)過氧化抑制活性的高低[15]。海蜆多糖脂質(zhì)過氧化抑制活性的測試結(jié)果見圖4。

圖4 海蜆粗多糖及純化組分的脂質(zhì)過氧化抑制活性Fig.4 Lipid peroxidation inhibition activity of CP，F(xiàn)1，F(xiàn)2 and F3

由圖4可以看出，海蜆多糖具有一定脂質(zhì)過氧化抑制活性。多糖質(zhì)量濃度對脂質(zhì)過氧化抑制活性影響達(dá)到極顯著水平（P＜0.01）。隨著多糖質(zhì)量濃度提高，脂質(zhì)過氧化抑制活性呈上升趨勢。對CP、F1、F2、F3來說，多糖質(zhì)量濃度較低時（0～0.8 mg/mL）時，脂質(zhì)過氧化抑制活性隨著多糖質(zhì)量濃度的提高呈較顯著的上升趨勢；多糖質(zhì)量濃度較高時（3.2～4.0 mg/mL）時，脂質(zhì)過氧化抑制活性隨著多糖質(zhì)量濃度的提高上升趨勢不顯著。

在實驗設(shè)計的范圍內(nèi)（0～4.0 mg/mL），海蜆多糖的脂質(zhì)過氧化抑制活性由小到大的順序為F2＜F1＜F3＜CP。 多糖質(zhì)量濃度為 4.0 mg/mL 時，CP、F1、F2、F3的脂質(zhì)過氧化抑制活性分別為59.6%、45.1%、43.4%、51.0%。高質(zhì)量濃度時（3.2、4.0 mg/mL），海蜆多糖的脂質(zhì)過氧化抑制能力與Vc較為接近，表明海蜆多糖具有具中等的脂質(zhì)過氧化抑制活性。海蜆多糖的脂質(zhì)過氧化抑制活性可能是其在清除自由基、螯合金屬離子、還原能力等方面活性的綜合反映。

3 結(jié)語

1）采用DEAE-纖維素柱層析法對海蜆多糖進(jìn)行初 步 分離 ， 獲 得 3 個 組 分 （F1、F2、F3）。 采 用Sephdex G-100凝膠柱層析進(jìn)一步分離純化，獲得3個純化組分（f1、f2、f3）。 對 f1、f2、f3的純度進(jìn)行鑒定，結(jié)果表明，f1、f2、f3為均一的多糖組分。

2）采用苯酚-硫酸法、硫酸-間羥聯(lián)苯法、考馬斯亮藍(lán)法、氯化鋇-明膠法分別對海蜆多糖中總糖、糖醛酸、蛋白質(zhì)、硫酸基含量進(jìn)行分析。結(jié)果表明，CP、f1、f2、f3總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為 83.81%、98.75%、95.58%、84.71%；糖醛酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為1.58%、0.16%、0.96%、2.13%；硫酸基質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.92%、1.22%、2.08%、3.58%；CP、f3蛋白質(zhì)分別為3.08%、6.34%，f1、f2均未能檢出；HPLC 分析結(jié)果表明，f1、f2、f3的平均相對分子質(zhì)量分別為 68 600、80 600、100 600。

3）采用化學(xué)方法對 CP、f1、f2、f3進(jìn)行體外抗氧化活性測定。結(jié)果表明，海蜆多糖具有不同的還原力、脂質(zhì)過氧化抑制活性、金屬離子螯合能力。

[1]Lu Y，Wang D，Hu Y，et al.Sulfated modification of epimedium polysaccharide and effects of the modifiers on cellular infectivity of IBDV[J].Carbohydrate Polymers，2008，71（2）：180-186.

[2]Alban S，Schauerte A，F(xiàn)ranz G.Anticoagulant sulfated polysaccharides：Part I.Synthesis and structure-activity relationships of new pullulan sulfates[J].Carbohydrate Polymers，2002，47（3）：267-276.

[3]湛孝東.貝類多糖生物學(xué)活性研究進(jìn)展[J].時珍國醫(yī)國藥，2006，17（7）：1285-1286.ZHAN Xiao-dong.Progress on biological activities of polysaccharides from shellfish[J].LiShiZhen Medicine and Materia Medica Research，2006，17（7）：1285-1286.（in Chinese）

[4]喬德亮，曾曉雄.三角帆蚌多糖制備及基本理化性質(zhì)[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報，2011，1：70-77.QIAO De-liang，ZENG Xiao-xiong.Preparation and preliminary feature of polysaccharides from Hyriopsis cumingii[J].Journal of Food Science and Biotechnology，2011，1：70-77.（in Chinese）

[5]Dubois M，Gilles K A，Hamilton J K，et al.Colorimetric method for determination of sugars and related substances[J].Analytical Chemistry，1956，28（3）：350-356.

[6]Bradford M M.A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding[J].Analytical Biochemistry，1976，72（1-2）：248-254.

[7]Blumenkrantz N，Asboe-Hansen G.New method for quantitative determination of uronic acids[J].Analytical Biochemistry，1973，54（2）：484-489.

[8]Dodgson K，Price R.A note on the determination of the ester sulphate content of sulphated polysaccharides[J].Biochemical Journal，1962，84（1）：106-110.

[9]Roy SK，Maiti D，Mondal S.Structural analysis of a polysaccharide isolated from the aqueous extract of an edible mushroom，Pleurotus sajor-caju，cultivar Black Japan[J].Carbohydrate Research，2008，343（6）：1108-1113.

[10]Liu C，Wang C，Xu Z，et al.Isolation，chemical characterization and antioxidant activities of two polysaccharides from the gel and the skin of Aloe barbadensis Miller irrigated with sea water[J].Process Biochemistry，2007，42（6）：961-970.

[11]Oyaizu M.Studies on products of the browning reaction.Antioxidative activities of browning reaction products prepared from glucosamine[J].Japanese Journal of Nutrition，1986，44（6）：307-315.

[12]Yen G C，Hsieh C L.Antioxidant activity of extracts from Du-zhong （Eucommia ulmoides）toward various lipid peroxidation models in vitro[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry，1998，46（10）：3952-3957.

[13]Yuan Y V，Bone D E，Carrington M F.Antioxidant activity of dulse （Palmaria palmata）extract evaluated in vitro[J].Food Chemistry，2005，91（3）：485-494.

[14]Janero D R.Malondialdehyde and thiobarbituric acid-reactivity as diagnostic indices of lipid peroxidation and peroxidative tissue injury[J].Free Radical Biology and Medicine，1990，9（6）：515-540.

[15]Tsuda T，Watanabe M，Ohshima K，et al.Antioxidative activity of the anthocyanin pigments cyanidin 3-O-.beta.-D-glucoside and cyanidin[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry，1994，42（11）：2407-2410.