匡 華， 勇倩倩， 劉麗強， 胡擁明， 宋珊珊， 胥傳來

（江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無錫214122）

蘇丹紅類染料已被國際癌癥研究機構(gòu)將歸為三類致癌物，即動物致癌物。肝臟是蘇丹紅作用的主要靶器官，此外蘇丹紅類物質(zhì)還可引發(fā)膀胱、脾臟等臟器的腫瘤，同時蘇丹紅還具有遺傳毒性。1995年歐盟等國家禁止蘇丹紅作為食品添加劑[1]，頻頻發(fā)生的蘇丹紅事件，給食品安全敲響了警鐘。我國也在1996年的《食品添加劑衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》中明令禁止在食品工業(yè)中使用蘇丹紅［2］。然而，但由于蘇丹紅染料價廉易得，色澤鮮亮持久等特點，印度等一些國家在加工辣椒粉的過程中還容許添加蘇丹紅I。我國2005年在對全國18個省、市、區(qū)可能含有蘇丹紅的食品展開專項檢查后發(fā)現(xiàn)，在30多家生產(chǎn)企業(yè)的88種食品及食品添加劑含有違禁添加物蘇丹紅[3-8]。關(guān)于蘇丹紅的檢測方法，國內(nèi)外常用的是高效液相色譜法，高效液相－質(zhì)譜聯(lián)用法、氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用法等[9-16]。做為一種快速檢測技術(shù)，酶免疫檢測方法具有廉價、高通量、靈敏的優(yōu)點。作者通過對蘇丹紅Ⅰ的結(jié)構(gòu)改造，制備了抗原和兔源多克隆抗體。在此基礎(chǔ)上，建立了辣椒粉中蘇丹紅Ⅰ的ELISA測定方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蘇丹紅Ⅰ，蘇丹紅Ⅱ，蘇丹紅Ⅲ，蘇丹紅Ⅳ，2-萘酚，對氨基苯丁酸，N，N-二環(huán)己基碳二亞胺（dicyclohexylcarboimide，DCC）， 福氏完全佐劑和不完全佐劑等均：購自Sigma公司；蘇丹紅G，對位紅和聚乙烯醇（PVA）：購自上海晶純試劑有限公司；聚乙二醇（PEG）：購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司；聚乙烯吡咯烷酮（PVP），酪蛋白：購自北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司；牛血清蛋白（Bovine serum albumin，BSA），卵清白蛋白（Ovalbumine，OVA）：購自上海伯奧生物科技公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG（HRP-IgG）：購自康成生物工程公司；四甲基聯(lián)苯胺（TMB）：購自華美生物工程公司。

1.2 儀器與設(shè)備

石英自動雙重純水蒸餾器：金壇市榮華儀器制造有限公司產(chǎn)品；ZD-9556水平搖床：太倉科教器材廠產(chǎn)品；Costar96孔8×12可拆酶標(biāo)板：購自上海吉泰生物科技有限公司；Multiska Mks酶標(biāo)儀以及可調(diào)試移液器為：Thermo Labsystems公司產(chǎn)品；電子天平AB104-N：購自上海Metller Toledo Group；U-3000紫外掃描儀：購自日本島津公司；DHG-9070A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：購自上海精宏實驗設(shè)備有限公司；RJ-LD-IIB低速離心機：購自無錫市瑞江分析儀器有限公司；液相色譜－質(zhì)譜儀（WATERS MALDI SYNAPT Q-TOF MS）：購自美國waters公司，采用電噴霧（ESI）離子源。

1.3 半抗原合成

取對氨基苯丁酸（PAPA）179.2 mg，加入4 mL 1 mol/L的鹽酸，再加入NaNO2，至淀粉試紙變藍(lán)，4℃反應(yīng)30 min，得到A液。 取2-奈酚144.2 mg，溶解在無水乙醇中，得到B液。把A液緩慢滴加入B液中，溶液立即變紅色，用NaOH調(diào)pH 8～9左右，產(chǎn)生大量絮狀沉淀，室溫反應(yīng)1 h，離心取沉淀，烘干，備用，即得蘇丹紅衍生物H-1，另外，用對氨基苯甲酸（PABA）代替對氨基苯丁酸，按照上述合成途徑，制備蘇丹紅衍生物H-2。將產(chǎn)物進(jìn)行液相色譜－質(zhì)譜鑒定。

1.4 完全抗原合成

以BSA載體蛋白為例，首先活化載體蛋白。取無水乙二胺67 mL，加雙蒸水，再加入6mol/L HCL 50 mL，冰浴冷卻至25℃，調(diào)pH至4.7，加入BSA 5 g，溶于25 mL純水中，加入EDC 1.8 g，維持原溫度和pH，攪拌反應(yīng)2 h，加入4 mol/L醋酸緩沖液30 mL，終止反應(yīng)，在4℃純水中透析，凍干，保存?zhèn)溆谩?/p>

稱取半抗原34.2 mg，溶解在2 mL二甲基甲酰胺（DMF）中，調(diào) pH 在 8～9，加入 DCC 25 mg，NHS 21 mg，室溫反應(yīng)12 h，離心取上清。將活化后的蛋白30 mg溶解在2 mL 0.05 mol/L的碳酸鹽緩沖液[16]中。將半抗原溶液上清緩慢滴加到蛋白溶液中，緩慢攪拌，過夜反應(yīng)。然后，將將反應(yīng)液裝入透析袋，4℃下用0.01 mol/L的NaHCO3溶液中透析3 d。透析后溶液經(jīng)離心取上清液，分裝后，在－20℃下保存。按照上述方法，制備OVA的絡(luò)合物。

1.5 抗體制備和鑒定

將制備的完全抗原（BSA偶聯(lián)物）做為免疫原免疫新西蘭大白兔，動物免疫的方法參考文獻(xiàn)。在第5次免疫后10天，心臟采血，分離血清，用間接酶聯(lián)免疫方法（ELISA）測試血清。將OVA偶聯(lián)物做為包被抗原，用方陣法測定抗原抗體的最佳稀釋比[17]。采用以下的ELISA操作過程[18]：

1.5.1 包被 將包被抗原用包被緩沖液 （0.05 mol/L，pH 9.6的碳酸鹽緩沖液）作系列稀釋后，按列包被96孔酶標(biāo)板，100 μL/孔，于4℃冰箱放置過夜。

1.5.2 封閉 取出過夜包被的酶標(biāo)板回升至室溫，每孔加入200 μL PBST洗滌液（含有0.05%tween-20，0.01 mol/L，pH 7.4磷酸鹽緩沖液），水平搖床上振蕩3 min，用力甩掉洗液并在吸水紙上拍干，繼續(xù)洗滌3次。用封閉緩沖液（含有0.5%BSA的PBST溶液）封閉酶標(biāo)板，200 μL/孔，于 37℃溫育箱內(nèi)溫育2 h后取出酶標(biāo)板，洗滌4次，37℃烘干待用。

1.5.3 ELISA測定 取封閉好的酶標(biāo)板，對照孔中添加測定液（含有體積分?jǐn)?shù)20%甲醇的磷酸鹽緩沖液）50 μL/孔，測試孔中添加用樣本測定液系列稀釋的 蘇 丹 紅 標(biāo) 準(zhǔn) 溶 液 （0.1，0.2，0.5，1，2，5，10，20，50 ng/mL），50 μL/孔；每個濃度設(shè)置 5 個重復(fù)。 然后每孔添加抗體溶液，50 μL/孔，放置于37℃ 30min孵育。之后，棄去微孔板中的溶液，采取上述洗滌方法洗滌微孔板，拍干。加入酶標(biāo)記抗體HRP-IgG溶液（1∶3 000 稀釋），100 μL/孔，37 ℃ 30min 孵育。 反應(yīng)結(jié)束后，棄去微孔中溶液，洗滌微孔板4次，拍干。加入底物液100 μL/孔[60 mg TMB溶于100 mL乙二醇；底物緩沖液（0.933 g檸檬酸+3.68 g Na2HPO4·12H2O+18 μL體積分?jǐn)?shù)30%H2O2，用超純水定容至100 mL；將兩種溶液在使用前按照1∶5的體積比混勻）。將酶標(biāo)板放置于暗處反應(yīng)15 min，之后，加終止液（2 mol/L 硫酸溶液），50 μL/孔。 用酶標(biāo)儀測定各個孔在450 nm波長下的吸光值A(chǔ)450，求出各濃度的B/B0值［B校正值為A實測值（均值）－A空白值（均值）；B0為標(biāo)準(zhǔn)溶液為0 ng/mL時，即陰性對照孔的校正值］；建立以B/B0為縱坐標(biāo)，蘇丹紅質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)的抑制曲線。半數(shù)抑制率 （IC50）為達(dá)到50%最大吸光值（Amax）所需的蘇丹紅濃度。

1.6 ELISA檢測方法的優(yōu)化 對包被液 （分別用pH 7.4的PBS緩沖液、pH 8.0的Tris-HCL緩沖液、pH 9.6的CBS緩沖液）、封閉液 （在0.05 mol/L的CBS溶液中分別加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%，0.2%，0.5%的明膠、酪蛋白，聚乙烯吡咯烷酮PVP、聚乙二醇PEG等）、抗體稀釋液 （在PBST溶液中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%，0.2%，0.5%的明膠，BSA）、 樣品稀釋液（PBS、PBST、10%甲醇 PBS、PBST+2%PVP、PBST+2%PEG、PBST+2%OVA）、反應(yīng)時間（30 min、45 min、60 min）進(jìn)行優(yōu)化，選擇Amax吸光值在1.5～1.8之間，IC50最低的條件作為最佳操作條件。

1.7 交叉反應(yīng)測定

在最佳操作條件下，測定ELISA體系對蘇丹紅Ⅰ，蘇丹紅Ⅱ，蘇丹紅Ⅲ，蘇丹紅Ⅳ，對位紅等類似物的IC50值，按照以下公式：交叉反應(yīng)率（CR%）=蘇丹紅ⅠIC50值/類似物IC50值 ×100% 計算交叉反應(yīng)率。

1.8 辣椒粉中蘇丹紅的ELISA測定

分別稱取陰性辣椒粉1 g，按照5、20 ng/g兩個水平進(jìn)行樣本添加試驗，同時設(shè)定空白對照。加入甲醇5 mL萃取，混勻，超聲10 min，離心去上清，收集清液。然后在剩余物中再加入5 mL甲醇重復(fù)提取一次，離心去上清，合并兩次提取液，用氮氣吹干，然后用ELISA樣品稀釋液溶解殘渣，采用上述建立的ELISA方法進(jìn)行檢測，并計算回收率。

2 材料與方法

2.1 半抗原的鑒定

2.1.1 半抗原H-1的鑒定 圖1是提純后的1-[（4-丁酸苯）偶氮]-2-萘酚（即 H-1，相對分子質(zhì)量為324）的色譜－質(zhì)譜表征圖。在總離子圖，即圖1（a）中能看到分別在6.15 min和5.26 min有2個吸收峰，蘇丹紅特征吸收485 nm下有特征紫外吸收。經(jīng)過質(zhì)譜圖比較，5.26 min處為蘇丹紅母體物質(zhì)，6.15 min 處為目標(biāo)物質(zhì)（H-1）。如圖 1（b）中所示，在正離子檢測模式下，在6.15 min處，得到分子離子峰m/z 325（M+1）的碎片，分析分子碎片符合衍生物的結(jié)構(gòu)特征，液相圖、質(zhì)譜圖相互應(yīng)證表明半抗原衍生化成功。

2.1.2 半抗原H-2的鑒定 圖2是提純后的1-[（4-甲酸苯）偶氮]-2-萘酚 （H-2， 相對分子質(zhì)量292）的質(zhì)譜圖，在總離子圖，圖2（a）中能看到分別在4.2 min和2.45 min有2個吸收峰，其中4.2 min處峰為目標(biāo)物質(zhì)H-2的色譜峰；2.45 min處的色譜峰為母體物質(zhì)。在負(fù)離子檢測模式下，如圖2（b）所示，得到m/z 291（M-1）的分子離子峰碎片，分析分子碎片符合衍生物的結(jié)構(gòu)特征，液相圖、質(zhì)譜圖相互應(yīng)證表明半抗原衍生化成功。

圖1 半抗原H-1的質(zhì)譜鑒定結(jié)果Fig.1 Identification of the H-1by LC/MS

圖2 半抗原H-2的色譜－質(zhì)譜鑒定Fig.2 Identification of the hapten H-2 by LC/MS

2.2 完全抗原的合成和鑒定

2.2.1 紫外鑒定 以半抗原H-1（SUDAN-PABA）的偶聯(lián)物鑒定為例，從圖3可見，蘇丹紅衍生物的特征吸收波長在485 nm，BSA活化物（CBSA）的特征吸收波長為278 nm，偶聯(lián)產(chǎn)物SUDAN-PAPACBSA分別在278 nm和485 nm都有特征吸收峰，在紫外掃描圖中表現(xiàn)出各自光譜迭加的性質(zhì)，證明偶聯(lián)結(jié)合實驗的成功。計算得抗原溶液的蛋白濃度為6.05 mg/mL，根據(jù)蘇丹紅的特征吸收峰，計算出蘇丹紅半抗原的摩爾數(shù)量，因而得到偶聯(lián)率15.6。同樣地，從圖4可見-OVA偶聯(lián)產(chǎn)物分別在278 nm和485 nm都有特征吸收峰，證明偶聯(lián)成功。計算偶聯(lián)率為10.4。采用上述方法同樣測定了H-2衍生物（H-2-BSA，H-2-OVA的偶聯(lián)率分別為 17.3和11.2）

圖3 完全抗原SUDAN-PAPA-CBSA的紫外掃描圖譜Fig.3 Identification of the SUDAN-PAPA-CBSA by UV

圖4 完全抗原SUDAN-PABA-OVA的紫外掃描圖譜Fig.4 Identification of the SUDAN-PABA-OVA by UV

2.2.2 電泳表征 以 H-1（SUDAN-PABA）的 BSA偶聯(lián)物鑒定為例，如圖5所示，分別將BSA和偶聯(lián)物進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電泳方向是由上至下。從圖中可以看出免疫原的遷移速度相比CBSA的速度要慢，進(jìn)一步證明偶聯(lián)成功。

圖5 免疫原電泳圖Fig.5 SDS-PAGE of BSA conjugates

2.3 抗體的鑒定

以O(shè)VA偶聯(lián)物做包被原，用包被緩沖液系列稀釋成 1∶1 000、1∶2 000、1∶4 000、1∶8 000、1∶16 000、1∶32 000，兔抗血清系列稀釋成 1∶1 000、1∶2 000、1∶4 000、1∶8 000、1∶16 000、1∶32 000 和 1∶64 000，進(jìn)行方陣測試，以陽性血清的A450nm≥陰性血清的2.1倍作為抗血清的效價，測定結(jié)果可知H-1-BSA和H-2-BSA兔血清的效價為64 000。

根據(jù)ELISA檢測的要求，選擇吸光值在1.5～1.8，同時陽性血清的A450nm≥陰性對照孔的2.1倍做為最適工作濃度，則兔血清最佳稀釋比例為1∶16 000；包被抗原稀釋度為 1∶4 000。

2.4 ELISA參數(shù)的優(yōu)化

2.4.1 包被液的選擇 試驗中比較了3種常用包被 液 ：0.01 mol/L CBS、0.01 mol/L PBS 以 及 0.01 mol/L Tris-HCl對ELISA關(guān)鍵指標(biāo)IC50和最大吸光度值（Amax）的影響，Amax/IC50愈高愈佳。從表 1可以看出，就Amax而言，碳酸鹽緩沖液包被時最高，其次為PBS溶液和生理鹽水。3種包被液對IC50的影響變化很大。采用Tris-HCl緩沖液時，Amax/IC50值遠(yuǎn)大于另外兩者。因此，TRIS-HCl緩沖液做為本試驗后續(xù)用包被溶液。

表1 包被溶液的優(yōu)化Table 1 Optimization of coating buffer

2.4.2 封閉液的選擇 在0.05 mol/L的CBS溶液中分別加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%，0.2%，0.5%的明膠、酪蛋白、PVP、PEG。從表2看到，當(dāng)使用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%明膠進(jìn)行封閉時，所測定的IC50最低，且Amax/IC50最高，所以選擇含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%明膠的CBS溶液做為封閉液。

表2 封閉液的優(yōu)化Table 2 Optimization of blocking solution

2.4.3 樣品稀釋液的選擇 分別選擇PBS、PBST、質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%甲醇PBS、PBST+質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%PVP、PBST+質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%PEG、PBST+質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%PVA做為樣品稀釋液，從表3看出，總體來講采用PBST溶液體系的比PBS體系的效果好。當(dāng)采用PBST+質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%PVP的做為樣品稀釋液時IC50最低，Amax/IC50最高，所以選擇PBST+質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%PVP的做為樣品稀釋液。

表3 樣品稀釋液的優(yōu)化Table 3 Optimization of sample solution

2.4.4 抗體稀釋液的選擇 在PBST溶液中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%，0.2%，0.5%的明膠，BSA，從表4可知，抗體稀釋液用PBST+0.2%BSA的條件下，IC50最低，Amax/IC50最高，所以選擇PBST+質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.2%BSA作為抗體稀釋液。

表4 抗體稀釋液的優(yōu)化

2.4.5 反應(yīng)時間優(yōu)化 加入抗血清后，設(shè)置在37℃分別選擇孵育時間30，45，60 min，結(jié)果表明，隨著時間的增加，最大吸光度值A(chǔ)max隨之增加，然而半數(shù)抑制率IC50（ng/mL）并無改善。因此將30 min做為抗血清捕獲抗原的最佳孵育時間。同樣地，加入酶標(biāo)記抗體后，優(yōu)化孵育時間（30、45、60 min），結(jié)果表明，無論是最大吸光度值A(chǔ)max還是增半數(shù)抑制率IC50（ng/mL）均無無改善，因此酶標(biāo)記抗體識別抗血清的反應(yīng)時間亦優(yōu)化為30 min。

2.5 標(biāo)準(zhǔn)抑制曲線

以B/B0為縱坐標(biāo)，以蘇丹紅Ⅰ標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度的對數(shù)值為橫坐標(biāo)作圖，得到蘇丹紅Ⅰ的標(biāo)準(zhǔn)抑制曲線，如圖6所示，IC50為3.0 ng/mL，線性范圍為0.3～32.4 ng/mL，以產(chǎn)生20%的抑制時的蘇丹紅Ⅰ質(zhì)量濃度x為檢測限，計算為0.1 ng/mL。

圖6 ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.6 Standard curve of ELISA

2.6 交叉反應(yīng)

在最優(yōu)化的條件下，分別測定該方法對蘇丹紅Ⅱ、蘇丹紅Ⅲ、蘇丹紅Ⅳ、蘇丹紅G和對位紅5個物質(zhì)的半數(shù)抑制率，結(jié)果如表5所示。從表5可知，該抗體對蘇丹紅Ⅰ的特異性較好，對蘇丹紅Ⅱ、Ⅲ、G有一定的識別能力，但交叉率均小于10%。與蘇丹紅Ⅳ幾乎沒有交叉反應(yīng)（＜0.1%），可能的原因在于蘇丹紅Ⅳ在苯環(huán)對位還有一個苯環(huán)，鄰位還有甲基，影響了與抗體的結(jié)合能力。由于對位紅和蘇丹紅Ⅰ有共同的苯環(huán)偶氮結(jié)構(gòu)，該抗體表現(xiàn)出對對位紅較好的識別能力，交叉反應(yīng)率達(dá)到了140%。

表5 交叉反應(yīng)率測定Table 5 Determination of the cross-reactivity

2.7 實際樣品添加回收率

由表6可見，采用本方法，辣椒粉中蘇丹紅Ⅰ的回收率在5 ng/g的添加水平下為90.4%，變異系數(shù)為1.80%。在20 ng/g的添加水平下為96%，變異系數(shù)為4.9%；回收率分別為和變異系數(shù)均滿足殘留檢測要求。

表6 辣椒粉樣本添加回收率結(jié)果Table 6 Recovery results of in chili powder samples

3 結(jié)語

通過對蘇丹紅Ⅰ結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造，制備了兩個蘇丹紅衍生物，將其做為半抗原，分別制備了免疫原和包被抗原。通過免疫大白兔獲得了兔源多克隆抗體，抗體的效價為1∶16 000。通過對影響ELISA測定的因素包括包被溶液、封閉溶液、樣品稀釋液以及抗體稀釋液等進(jìn)行優(yōu)化，建立了蘇丹紅的ELISA測定方法，線性范圍為0.3～23.4 ng/mL。交叉反應(yīng)表明，作者所制備的抗體除了對蘇丹紅Ⅰ和對位紅染料具有較好的親和性之外，對其他蘇丹紅染料的識別性較差，交叉反應(yīng)率均在10%以下。通過測試?yán)苯贩鄣奶砑訕颖?，表明該方法適用于食品中蘇丹紅Ⅰ的快速篩查。

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