占宏德 ， 李江華 *1，， 劉 龍 ， 堵國成 ， 陳 堅

（1.江南大學 工業(yè)生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122；2.江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫214122）

α-酮戊二酸（α-ketoglutarate，又 α-KG）作為三羧酸循環(huán)（TCA）的重要中間產物之一，在生物體內參與氨基酸、蛋白質、維生素的合成以及能量代謝，在各個領域有著重要的應用前景[1]。作為一種營養(yǎng)強化劑，α-KG可廣泛應用于食品、醫(yī)藥、有機合成、化妝品和飼料等工業(yè)中。傳統(tǒng)工業(yè)上，采用有機合成法生產α-KG，涉及一系列復雜的化學反應過程，從而存在原料來源、環(huán)境污染等方面的問題[2]。為此，國內外很多學者對微生物發(fā)酵法生產α-KG進行了研究。作者室通過研究，實現(xiàn)了發(fā)酵法生產α-KG[3]，并在5 m3發(fā)酵罐上進行了中試。

離子交換法用于提取各種生物活性代謝物質具有成本低，工藝操作方便，提煉效率高，設備結構簡單，以及節(jié)約大量的有機溶液等優(yōu)點[4]。已有文獻資料中也多見離子交換法用于有機酸等的提取。如李寅等[4]采用離子交換法從發(fā)酵液中提取丙酮酸；鄭輝杰等[5]用離子交換法對發(fā)酵液中乳酸的提取工藝進行了研究；余煒等[6]采用離子交換法從發(fā)酵液中提取L-亮氨酸；王岸娜等[7]離子交換層析色譜法分離殼聚糖。α-KG發(fā)酵液中含有一定量的副產物丙酮酸，增加了純化難度，有關α-KG的提取鮮有文獻報道。作者以離子交換法對α-KG的提取純化工藝進行了研究，為α-KG的提取與純化提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

離子交換樹脂：201×7、202、213、D201、D202、D301，浙江杭州爭光樹脂有限公司生產；粉末狀活性炭：國藥集團化學試劑有限公司生產；丙酮酸及α-KG試劑：購自生工生物工程（上海）有限公司；α-KG發(fā)酵液：作者所在實驗室發(fā)酵制備（發(fā)酵菌種：Yarrowia lipolytica WSH-Z06）。

高速冷凍離心機：HITACHI公司產品；恒溫搖床：上海欣蕊自動化設備有限公司產品；烘箱：上海貨德實驗設備有限公司產品；電子天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司產品；UV2450紫外分光光度計：Shimadzu公司產品；HPLC高效液相色譜：Aglilen公司產品。

1.2 實驗方法

1.2.1 發(fā)酵液預處理 采用靜態(tài)法對發(fā)酵液進行脫色處理。發(fā)酵液脫色：將脫色前發(fā)酵液和脫色后發(fā)酵液進行全波長掃描，采取平均法來確定吸收波長[8]。采用單因素變量法優(yōu)化脫色條件。在100 mL錐形瓶中加入25 mL發(fā)酵液，在不同的活性炭用量、pH、溫度和脫色時間條件下，于恒溫搖床上進行震蕩脫色。測定脫色后發(fā)酵液的吸光度，計算脫色率：脫色率（%）=（脫色前發(fā)酵液吸光值－脫色后發(fā)酵液吸光值）/脫色前發(fā)酵液吸光值×100%

1.2.2 樹脂的預處理及選型 樹脂的預處理：見參考文獻[9]。樹脂的選型：通過靜態(tài)試驗來選擇合適的樹脂進行實驗[4]。靜態(tài)試驗：準確量取已預處理好的離子交換樹脂6 mL，分別放入內盛80 mL一定濃度的α-KG溶液的100 mL的錐形瓶中，在恒溫搖床中28℃、200 r/min轉速下震蕩交換20 h，以減差法計算樹脂平衡吸附量。

1.2.3 固定床動態(tài)吸附與洗脫 離子交換柱采用1×20 mm的玻璃層析住，樹脂裝填量為14 mL。將預處理過的發(fā)酵液進行上樣，待樹脂吸附飽和后，用超純水洗去柱中殘留的發(fā)酵液。然后用洗脫液進行洗脫。經過試驗，采取階段洗脫策略[10-11]。分別收集流出液、洗脫液，測定其中α-KG和丙酮酸含量，分析樹脂的吸附情況以及α-KG和丙酮酸的分離情況。

1.2.4 分析方法 用HPLC法來檢測α-KG和丙酮酸的含量[3]。將待測樣品稀釋一定倍數(shù)，過濾后，HPLC檢測。流動相：5 mmol/L硫酸溶液（550 μL濃硫酸定容到2 L），用0.22 μm孔徑的微濾膜抽濾并脫氣。HPLC條件：Aminex HPX-87H ion exchange column，柱溫：35 ℃，進樣量：10 μL，流量：0.6 mL/min。檢測器：紫外檢測器；檢測波長：210 nm。

2 結果與討論

2.1 發(fā)酵液的脫色

2.1.1 吸收波長的確定 采用活性炭對發(fā)酵液進行脫色。將脫色前后的發(fā)酵液進行全波長掃描，如圖1所示。全波長掃描圖沒有特征吸收峰，因此采用平均法[8]，計算得到平均脫色率為64.4%，在440 nm到450 nm之間。不同波長下吸收光的顏色和觀察到的顏色之間的關系，如表1所示。而發(fā)酵液顏色呈淺黃色偏橙色，故確定440 nm為檢測波長。

圖1 全波長掃描Fig.1 Wavelength scanning

表1 吸收波長的顏色和觀察到的顏色Table 1 Absorption of light color and observed color

2.1.2 活性炭用量對脫色效果的影響 活性炭用量對脫色效果的影響如圖2所示。隨著活性炭用量的增加，脫色率也不斷增大，當活性炭用量為1.5 g/L時，脫色率達最大，為78.2%。故活性炭用量選擇1.5 g/L。

圖2 活性炭用量對脫色率的影響Fig.2 Effect of carbon dosage on decolorization rate of fermentation broth

2.1.3 脫色時間對脫色效果的影響 脫色時間對脫色效果的影響如圖3所示。脫色率在1 h時脫色率達到最大，為78.1%。隨著時間的延長，脫色率反而下降。分析原因可能是隨著脫色時間的延長，活性炭上吸附的色素物質會有一定程度的解吸附現(xiàn)象，直到吸附達平衡狀態(tài)。故選擇脫色時間為1 h。

圖3 脫色時間對脫色率的影響Fig.3 Effect of time on decolorization rate of fermentation broth

2.1.4 溫度對脫色效果的影響 溫度對脫色效果的影響如圖4所示。隨著溫度的升高，脫色率也逐漸增大，在溫度達50℃后，脫色率變化趨于平緩。升高溫度，能促進分子的運動，有利于提高活性炭的吸附效率。綜合能耗考慮，選擇脫色溫度為50℃。

2.1.5 pH對脫色效果的影響 pH對脫色效果的影響如圖5所示。隨著pH值的降低，脫色率逐漸增大，在pH 3.0時，脫色率最高，為71.3%。故最佳脫色pH值為3.0。

圖4 溫度對脫色率的影響Fig.4 Effect of temperature on decolorization rate of fermentation broth

圖5 pH對脫色率的影響Fig.5 Effect of pH on decolorization rate of fermentation broth

綜合以上脫色條件，進行脫色驗證，結果活性炭對發(fā)酵液的脫色率達到89.2%，脫色后的發(fā)酵液澄清透明帶有少許淺橙黃色 （440 nm下吸光值為0.015）。

2.2 樹脂的選型

通過靜態(tài)吸附試驗，得到各樹脂吸附能力，如表2所示。其中弱堿大孔型樹脂D301和強堿凝膠型樹脂202對α-KG具有較大的吸附容量，但D301的吸附容量最大，為109.3 mg/mL。而弱堿性樹在洗脫時較強堿性樹脂脂更易于目標產物的洗脫。故選擇弱堿大孔型樹脂D301作為本實驗的離子交換材料。

2.3 固定床上樣條件優(yōu)化

2.3.1 流量對流出曲線的影響 空間流量對流出曲線的影響如圖6所示。隨著上樣流量的增加，固液接觸時間變短，交換區(qū)域拉長，穿透點提前，流出曲線拉平展開，這不利于提高樹脂的利用率。在實驗范圍內選擇較低的流量2.67 BV/h較為合理。在實際生產中，可以根據(jù)實際情況，在上樣開始階段以高流量上樣，之后選擇低流量上樣至穿透，可以在保證柱子利用率的前提下，適當提高生產效率。

圖6 不同流量對流出曲線的影響Fig.6 Effect of space velocity on the effluent curve

2.3.2 質量濃度對流出曲線的影響 上樣質量濃度對流出曲線的影響如圖7所示。當質量濃度較低為9.03 g/L時，曲線拉平展開，交換區(qū)間拉長；當質量濃度為20.3 g/L和33.9 g/L時，曲線前半部分變化趨勢相似，但質量濃度為33.9 g/L時，曲線嚴重拖尾。分析原因可能是因為柱子體積較小導致吸附容量有限所致。故在實驗范圍內，α-KG的上樣質量濃度選擇為20 g/L較為合理，實際生產中可根據(jù)固定床大小來選擇其合適的上樣質量濃度。

圖7 不同上樣質量濃度對流出曲線的影響Fig.7 Effect of concentration of α-KG on the effluent curve

2.3.3 裝填高度對流出曲線的影響 在不同的裝填高度條件下進行上樣，得到流出曲線，如圖8所示。分析圖中曲線發(fā)現(xiàn)，不同的徑高比對流出曲線變化趨勢的影響不大。當徑高比為1∶24時，流出曲線坡度相對較緩，交換區(qū)域相對拉長，出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象。分析原因可能主要是由于樹脂裝填不嚴實所致。故在實驗條件下，選擇徑高比為1∶12較好。

圖8 徑高比對流出曲線的影響Fig.8 Effect of resin height on the effluent curve

2.4 洗脫條件優(yōu)化

由于發(fā)酵液中存有較高比例的丙酮酸，故將二者分離是α-KG純化過程中最關鍵的一步。經過試驗，確定采取階段洗脫策略來分離α-KG。

第一階段采用混合洗脫劑低濃度 （0.01 mol/L NaCl和0.01 mol/L HCl混合液）下進行洗脫，在損失一定量的α-KG的同時，將丙酮酸大量洗脫下來；第二階段則用HCl一次洗脫，可得到較純的α-KG溶液。收集洗脫液，測定其中α-KG和丙酮酸的含量，得到階段洗脫曲線，如圖9所示。第一階段洗脫體積240 mL，第二階段洗脫體積150 mL。在第二階段洗脫液中，丙酮酸的含量幾乎為零，α-KG的純化效果較好。分析圖9發(fā)現(xiàn)，洗脫液中所含丙酮酸的比例要遠遠低于原始發(fā)酵液中丙酮酸的含量，說明D301樹脂對α-KG的吸附選擇性較大。

圖9 階段洗脫曲線Fig.9 Stepwise elution curve

對第二階段洗脫液濃度和洗脫流量進行了優(yōu)化，如圖10所示。當洗脫流量為6 BV/h，洗脫劑濃度為0.3 mol/L HCl時，洗脫峰較集中，且峰高較大，洗脫效果最佳。

圖10 不同流量對第二階段洗脫曲線的影響Fig.10 Effect of elution velocity on elution curve

2.5 洗脫驗證

上樣至剛好穿透，記上樣體積V0，收集上樣流出液和洗柱液V1，第一階段洗脫液V2，第二階段洗脫液V3，測定其中α-KG和丙酮酸的含量，計算得率，結果如表3所示。在第一階段洗脫時，丙酮酸洗脫量為56.74 mg，遠遠大于α-KG的洗脫量6.21 mg；第二階段中，α-KG 大量洗脫，為93.67 mg。在上述階段洗脫策略下，最終α-KG收率達93.2%。在93.67 mg α-KG中含丙酮酸9.59 mg，由初始發(fā)酵液中α-KG與丙酮酸質量比1.5∶1提高到10∶1，更有利于后續(xù)的結晶。如果延長第一階段洗脫時間，則最終α-KG純度可進一步提高至完全不含丙酮酸，但α-KG的收率會有所下降。對比V0和V1中α-KG和丙酮酸的含量可知，D301樹脂對α-KG的吸附選擇性較大。因此可以設計串聯(lián)柱過量上樣，然后分柱洗脫，有助于α-KG和丙酮酸的分離。

表3 純化結果驗證Table 3 Consequence of purification

3 結語

通過全波長掃描，采取平均法確定檢測波長為440 nm。用活性炭對發(fā)酵液進行脫色，在活性炭用量1.5 g/L、pH 3.0、脫色時間 1 h、脫色溫度 50℃的條件下，脫色率可達89.2%。通過靜態(tài)試驗，選擇吸附量最大的弱堿大孔型樹脂D301為實驗用離子交換樹脂。上柱條件優(yōu)化表明，在發(fā)酵液中α-KG質量濃度20 g/L、較低的流量（2.67 BV/h）和較小的裝填高度（D∶H=1∶12）時，上樣吸附效果最好。 采用階段洗脫：第一階段用0.01 mol/L的NaCl和0.01 mol/L的HCl混合溶液進行洗脫，第二階段采用0.3 mol/L的HCl溶液進行洗脫，洗脫流速6 BV/h。在此工藝條件下驗證，洗脫液中α-KG與丙酮酸的質量比由初始發(fā)酵液中的 1.5∶1 提高為 10∶1，α-KG 收率可達93.2%，純化效果較好。該工藝可較好的純化α-KG，但依然存在一定的損失，而且丙酮酸完全浪費，可進一步嘗試其他洗脫策略，提高α-KG收率，并盡可能分離出丙酮酸，實現(xiàn)副產物的利用。

[1]Sauer M，Porro D，Mattanovich D，et al.Microbial production of organic acids：expanding the markets[J].Trends Biotechnol，2008，26（2）：100-108.

[2]Zhang D，Liang N，Shi Z，et al.Enhancement of α-ketoglutarate production in Torulopsis glabrata：Redistribution of carbon flux from pyruvate to α-ketoglutarate[J].Biotechnology and Bioprocess Engineering，2009，14（2）：134-139.

[3]YU Zong-zhong，DU Guo-cheng，ZHOU Jing-wen，et al.Enhanced a-ketoglutaric acid production in Yarrowia lipolytica WSHZ06 by an improved integrated fed-batch strategy[J].Bioresource Technology，2012，114：597-602

[4]李寅，傅為民，陳堅.離子交換法從發(fā)酵液中提取丙酮酸[J].無錫輕工大學學報，2001，20（4）：335-339.LI Yin，F(xiàn)U Wei-ming，CHEN Jian.Extract pyruvate from fermatation borth by Ion-exchange[J].Journal of Wuxi University of Light Industry，2001，20（4）：335-339.（in Chinese）

[5]鄭輝杰，李志強，何姍，等.離子交換法提取發(fā)酵液中乳酸的工藝研究[J].食品科學，2009，30（6）：84-87.ZHEN Hui-jie，LI Zhi-qiang，HE Shan，et al.Study on extraction process of lactic acid from fermentation broth with anionic resin[J].Food Science，2009，30（6）：84-87.（in Chinese）

[6]余煒，伍時華，王恒山，等.離子交換法分離提取發(fā)酵液中L-亮氨酸[J].化學世界，2005，46（2）：109-113.YU Wei，WU Shi-hua，WANG Heng-shan，et al.Separating and abstracting L-leucine from fermentation liquok with ion exchange[J].Chemical World，2005，46（2）：109-113.（in Chinese）

[7]王岸娜，王璋，許時嬰.離子交換層析色譜法分離殼聚糖[J].無錫輕工大學學報，2003，22（6）：75-80.WANG An’na，WANG Zhang，XU Shi-yin.Study on the separation of chitosan by ion exchange chromatography[J].Journal of Wuxi University of Light Industry，2003，22（6）：75-80.（in Chinese）

[8]樓良旺，高年發(fā).丙酮酸發(fā)酵液脫色工藝的研究[J].廣州食品工業(yè)科技，2004，20（3）：12-14.LOU Liang-wang，GAO Nian-fa.Decolorization of pyruvate fermentation broth[J].Guangzhou Food Science and Technology，2004，20（3）：12-14.（in Chinese）

[9]石慧東.離子交換法提取賴氨酸的研究[D].無錫：無錫輕工大學，1996.

[10]阮文輝.離子交換法分離純化5’-三磷酸胞苷的研究[D].南京：南京工業(yè)大學，2004.