王金鵬 ， 田耀旗 ， 周 星 ， 焦愛權 ， 趙建偉 ， 金征宇 *1，

（1.食品科學與技術國家重點實驗室 江南大學，江蘇 無錫 214122；2.江南大學 食品學院，江蘇 無錫 214122；3.食品安全與營養(yǎng)協(xié)同創(chuàng)新中心 江南大學，江蘇 無錫214122）

大環(huán)糊精（LR-CD）是由9個以上D-吡喃型葡萄糖單元通過α-1，4糖苷鍵連接而成的環(huán)狀糊精的統(tǒng)稱[1-2]，具有比常見環(huán)糊精更加優(yōu)越的水溶性及包埋性能[3]。合成大環(huán)糊精（LR-CD）的酶類被統(tǒng)稱為4-α-糖基轉移酶 （4αGtase）。 不同菌株來源的4αGtase的酶學性質具有很大的差異，這些差異導致LR-CD產率及聚合度范圍存在很大區(qū)別，例如來自Paenibacillus sp.F8的CGTase能夠作用淀粉產生聚合度6～9的環(huán)糊精，其中CD9的產量約為10%[4]；而來自T.aquaticus的Maltase能夠作用淀粉產生聚合度＞22的LR-CD，產率高達84%[5]。從酶本身來考慮，造成產物專一性差異的因素主要有：氨基酸序列差異、酶-淀粉結合區(qū)域差異、酶-淀粉結合位點差異及酶活性中心區(qū)域的差異等。作者所在實驗室構建了能夠表達產生4αGtase的菌株[6]，并驗證了該酶催化淀粉產生聚合度（DP）范圍為20～40的大環(huán)糊精，且最高轉化率達55%[7]，經核苷酸序列鑒定及生物信息學的方法分析發(fā)現4αGtase的α-螺旋/β-折疊比例為2.1，其中α-螺旋占23.3%，β-折疊占11.1%，酶的催化催化區(qū)域均勻分布在整個酶分子[8]。但是關于該酶的結構信息報道還非常少。為了加深對4αGtase的進一步了解，作者對4αGtase進行了化學修飾，深入探討該酶活性中心的氨基酸種類，以期為揭示4αGtase的結構特點提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

低相對分子質量標準蛋白：分析純，重慶升博科技有限公司產品；LB培養(yǎng)基（質量分數）（0.5%酵母膏，1%NaCl，1%蛋白胨）；氨芐青霉素鈉：美國Sigma公司產品；咪唑、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、HCl，及巰基乙醇：均為分析純，北京國藥集團產品；丁二酮（DIC）、苯甲基黃酰氯（PMSF）、氯氨-T（Ch-T）、N-溴代丁二酰亞胺 （NBS）、 焦碳酸二乙酯（DEPC）、碳二亞胺（EDC）、二硫蘇糖醇（DTT）：均為分析純，美國Sigma公司產品。

淋洗緩沖液（50 mmol/L Tris-HCl（pH 7.5）、300 mmol/L NaCl、20 mmol/L 咪唑）

洗脫緩沖液（50 mmol/L Tris-HCl（pH 7.5）、300 mmol/L NaCl、250 mmol/L 咪唑）。

SW-CJ-1F雙人單面超凈工作臺：蘇州安泰空氣技術有限公司產品；LS-B50L自動立式電熱壓力蒸汽滅菌鍋：上海華線醫(yī)用核子儀器有限公司產品；3K30冷凍離心機：美國SIGMA公司產品；JYD-650超聲波細胞粉碎機：上海三信儀器有限公司產品；RJ-TDL-50A底物臺式大容量離心機：江蘇瑞江分析儀器公司產品；純泰Ni-NTA親和層析柱（5 mL），生物醫(yī)藥純化技術公共服務平臺，AKTA purifier 900蛋白純化系統(tǒng)：瑞典AKTA公司產品。

1.2 方法

1.2.1 質粒的轉化 采用氯化鈣法制備感受態(tài)細胞并對攜帶目標基因的p6×HTAaGT Ampr質粒進行轉化，具體過程參見文獻[9]。

1.2.2 4αGtase粗酶的提取 挑取陽性轉化的基因工程菌單菌落，37℃培養(yǎng)8 h后，4 000 r/min離心10 min收集菌體，將菌體分散在約10 mL的Tris-HCl緩沖液（pH 7.5，50 mmol/L）中，冰浴下采用超聲破壁的方法提取粗酶液，超聲破壁提取條件為：功率300 W，超聲時間3 s，間歇時間 5 s，超聲次數180次。

1.2.3 4αGtase的分離純化 采用Ni-NTA親和層析柱對重組蛋白進行純化，并采用不連續(xù)垂直平板電泳系統(tǒng)對純化后的目標酶進行純度鑒定。分離膠質量濃度15 g/L，濃縮膠質量濃度5 g/L，電泳采用pH 7.5的Tris-HCl緩沖體系，考馬斯亮藍R-250染色。

1.2.4 4αGtase的活性測定 酶活分析采用碘比色法。準確吸取100 μL體積分數90%DMSO溶解的質量分數0.2%的直鏈淀粉溶液，置入2 mL離心管中，加入 800 μL 50 mmol/L Tris-HCl（pH 7.5），用漩渦混合器將其混勻，置于超級恒溫金屬浴中75℃保溫10 min，加入100 μL酶液，立即混勻并開始計時，當75℃保溫10 min后，立即取出100 μL反應液加入到900 μL稀碘液，搖勻。以稀碘液為空白，采用三波長分光光度法（TWC）測定反應溶液中大環(huán)糊精的生成量，采用正交函數分光光度法來測定反應溶液中直鏈淀粉的下降量。

酶活定義：在測定條件下，每分鐘轉化生成1 μg大環(huán)糊精所需要的酶量為1 U的環(huán)化活性；每分鐘轉化1 μg直鏈淀粉所需要的酶量為1 U的總活性。

1.2.5 4αGtase的化學修飾

1）化學修飾劑對4αGtase的穩(wěn)定性影響 分別采用精氨酸修飾劑DIC、蛋氨酸修飾劑ChT、色氨酸修飾劑NBS、組氨酸修飾劑DEPC、羧基修飾劑EDC、二硫鍵修飾劑DTT及蛋白變性劑巰基乙醇等修飾劑與等量4αGtase進行混合，達到各自所需修飾濃度，在25℃下保溫30、60、90 min，然后測定4αGtase催化淀粉產生大環(huán)糊精的量及淀粉的下降量，在同樣的條件下測定未加修飾劑的4αGtase環(huán)化活性及總酶活的影響。

2）化學修飾劑對4αGtase活性的影響 分別將上述化學修飾劑與4αGtase進行不同比例混合，并保持總體積一致，測定經不同濃度修飾的4αGtase環(huán)化活性及總酶活的變化。

2 結果與分析

2.1 精氨酸的化學修飾

精氨酸殘基含有1個強堿性的胍基，可以與丁二酮可逆的生成精氨酸-丁二酮復合物[13]。向4αGtase中加入 0.1 mmol/L的DIC，分別保溫 30、60、90 min，結果見圖 1（a）。 由圖 1（a）可以看出，在90 min的修飾時間內，經DIC修飾的4αGtase環(huán)化活性及總酶活性基本保持穩(wěn)定，因此選擇30 min作為修飾時間，進一步探討DIC濃度對4αGtase活性的影響，結果見圖 1（b）。 由圖 1（b）可以看出，不同濃度的DIC添加對大環(huán)糊精含量及直鏈淀粉的含量基本無明顯變化，統(tǒng)計學分析顯示無明顯差異，表明精氨酸不是4αGtase活性中心的必須基團。

圖1 （a）DIC對4αGtase穩(wěn)定性的影響，（b）DIC濃度對4αGtase活性的影響Fig.1 （a）The effect of DIC on the stability of 4αGtase，（b）Effect of DIC concentration on the activity of 4αGtase

2.2 蛋氨酸的化學修飾

向4αGtase中加入0.1 mmol/L的ChT，分別保溫 30、60、90 min，結果見圖 2（a）。 由圖 2（a）可以看出，在60 min的時間內，隨著保溫時間延長，大環(huán)糊精含量呈現明顯上升趨勢，而且直鏈淀粉含量呈現明顯下降趨勢，表明低濃度ChT修飾能夠促進4αGtase的環(huán)化活性及總酶活。在 90 min時，4αGtase的活性基本保持穩(wěn)定，因此選擇90 min作為修飾時間，進一步探討ChT濃度對4αGtase活性的影響，結果見圖 2（b）。 由圖 2（b）可以看出，隨著ChT添加濃度增加到10 mmol/L時，大環(huán)糊精質量濃度由0.26 mg/mL下降至0.16 mg/mL，環(huán)化活性下降了38.5%；直鏈淀粉的質量濃度由425 μg/mL下降至307 μg/mL表明總酶活提高了27.8%。該結果說明蛋氨酸可能位于4αGtase的淀粉結合區(qū)域，而非催化區(qū)域。

圖2 （a）ChT對4αGtase穩(wěn)定性的影響，（b）ChT濃度對4αGtase活性的影響Fig.2 （a）The effect of ChT on the stability of 4αGtase，（b）Effect of ChT concentration on the activity of 4αGtase

2.3 色氨酸的化學修飾

向4αGtase中加入0.1 mmol/L的NBS，分別保溫 30、60、90 min，結果見圖 3（a）。 由圖 3（a）可以看出，在60 min的時間內，隨著保溫時間延長，大環(huán)糊精含量呈現明顯上升趨勢，而且直鏈淀粉含量呈現明顯下降趨勢，表明低濃度NBS修飾能夠促進4αGtase的環(huán)化活性及總酶活。在 90 min時，4αGtase的活性基本保持穩(wěn)定，因此選擇90 min作為修飾時間，進一步探討NBS濃度對4αGtase活性的影響，結果見圖 3（b）。由圖 3（b）可以看出，隨著NBS添加濃度提高到10 mmol/L，大環(huán)糊精質量濃度由0.26 mg/mL增加到0.27 mg/mL，環(huán)化活性增加了3.8%；直鏈淀粉質量濃度由425 μg/mL減低到357 μg/mL，總酶活增加了16%，當修飾劑濃度超過10 mmol/L時，酶活基本不變，表明所有的色氨酸均被修飾。表明色氨酸可能是4αGtase催化活性中心的關鍵氨基酸之一。

圖3 （a）NBS對4αGtase穩(wěn)定性的影響，（b）NBS濃度對4αGtase活性的影響Fig.3 （a）The effect of NBS on the stability of 4αGtase，（b）Effect of NBS concentration on the activity of 4αGtase

2.4 組氨酸的化學修飾

向4αGtase中加入0.1 mmol/L的DEPC，分別保溫 30、60、90 min，結果見圖 4（a）。 由圖 4（a）及 4（b）可以看出，DEPC的加入使4αGtase迅速失活，圖4（b）也表明不同濃度的DEPC能夠造成4αGtase的環(huán)化活性及總酶活均完全失活，表明組氨酸是位于催化中心的關鍵氨基酸。

圖4 （a）DEPC對4αGtase穩(wěn)定性的影響，（b）DEPC濃度對4αGtase活性的影響Fig.4 （a）The effect of DEPC on the stability of 4αGtase，（b）Effect of DEPC concentration on the activity of 4αGtase

2.5 羧基的化學修飾

EDC是羧基（谷氨酸/天冬氨酸）專一性修飾試劑。向4αGtase中加入0.1 mmol/L的EDC，分別保溫 30、60、90 min，結果見圖 5（a）。 由圖 5（a）可以看出，在30 min的時間內，隨著保溫時間延長，大環(huán)糊精含量呈現明顯下降趨勢，而且直鏈淀粉含量呈現明顯上升趨勢，表明低濃度EDC修飾能夠使4αGtase的環(huán)化活性及總酶活均降低。在30 min時，4αGtase的活性基本保持穩(wěn)定，因此選擇30 min作為修飾時間，進一步探討EDC濃度對4αGtase活性的影響，結果見圖 5（b）。 由圖 5（b）可以看出，隨著EDC添加濃度提高到10 mmol/L，大環(huán)糊精質量濃度由0.53 mg/mL降低到0.41 mg/mL，環(huán)化活性降低了22.6%；直鏈淀粉質量濃度由108 μg/mL升高到161 μg/mL，總酶活降低了 58.3%，表明 4αGtase 的環(huán)化活性及總酶活均得到抑制，說明酶的活性中心存在有關鍵性的谷氨酸及天冬氨酸，這一結果和4αGtase結構生物信息學分析結果相一致[8]。

圖5 （a）EDC對4αGtase穩(wěn)定性的影響，（b）EDC濃度對4αGtase活性的影響Fig.5 （a）The effect of EDC on the stability of 4αGtase，（b）Effect of EDC concentration on the activity of 4αGtase

2.6 二硫鍵的化學修飾

向4αGtase中加入0.1 mmol/L的DTT，分別保溫 30、60、90，結果見圖 6（a）。由圖 6（a）可以看出，在30 min的時間內，隨著保溫時間延長，大環(huán)糊精含量呈現明顯下降趨勢，而且直鏈淀粉含量呈現明顯上升趨勢，表明低濃度DTT修飾能夠使4αGtase的環(huán)化活性及總酶活均降低。在30 min時，4αGtase的活性基本保持穩(wěn)定，因此選擇30 min作為修飾時間，進一步探討DTT濃度對4αGtase活性的影響，結果見圖5（b）。由圖 5（b）可以看出，隨著 DTT添加濃度提高到50 mmol/L，大環(huán)糊精質量濃度由0.23 mg/mL降低到0.1 mg/mL，環(huán)化活性降低了56.5%；直鏈淀粉質量濃度由 101 μg/mL升高到 177 μg/mL，總酶活降低了75.2%，這表明二硫蘇糖醇還原了酶的二硫鍵后，破壞了酶的高級結構，影響酶的穩(wěn)定性。

圖6 （a）DTT對4αGtase穩(wěn)定性的影響，（b）DTT濃度對4αGtase活性的影響Fig.6 （a）The effect of DTT on the stability of 4αGtase，（b）Effect of DTT concentration on the activity of 4αGtase

2.7 空間結構的化學修飾

向4αGtase中加入0.1 mmol/L的巰基乙醇，分別保溫 30、60、90 min，結果見圖 7（a）。 由圖 7（a）可以看出，在90 min的修飾時間內，經巰基乙醇修飾的4αGtase環(huán)化活性及總酶活性基本保持穩(wěn)定，因此選擇30 min作為修飾時間，進一步探討巰基乙醇濃度對4αGtase活性的影響，結果見圖7（b）。由圖7（b）可以看出，巰基乙醇濃度達到0.1 mmol/L時，4αGtase的環(huán)化活性幾乎不變，總酶活增加了42.6%，表明空間結構的改變造成4αGtase催化區(qū)域以及與淀粉結合區(qū)域的變化不盡相同，再次證明了4αGtase也許同時存在催化區(qū)域和淀粉鍵合區(qū)域。

3 結語

在一定的條件下，4αGtase經DIC修飾后活性基本無明顯變化；而經DEPC、EDC、DTT等修飾后4αGtase的環(huán)化活性及總酶活都有不同程度的下降，表明組氨酸、谷氨酸/天冬氨酸是構成4αGtase活性中心的關鍵氨基酸，二硫鍵對于維持4αGtase活性中心的空間結構具有重要作用；ChT、NBS、巰基乙醇等的修飾分別造成了總酶活不同程度的增加，而ChT修飾卻導致環(huán)化活性下降、NBS修飾引起環(huán)化活性上升、巰基乙醇修飾對環(huán)化活性基本無影響，推測造成這個復雜現象的可能是酶分子同時存在淀粉鍵合區(qū)域和催化區(qū)域，蛋氨酸、色氨酸在兩個區(qū)域存在狀態(tài)不盡相同，空間結構的適當變換能夠促進該酶與淀粉的結合，從而有利于總酶活的增加。

圖7 （a）巰基乙醇對4αGtase穩(wěn)定性的影響，（b）巰基乙醇濃度對4αGtase活性的影響Fig.7 （a）The effect of mercaptoethanol on the stability of 4αGtase， （b）Effect of mercaptoethanol concentration on the activity of 4αGtase

[1]Ueda H，Endo T.Large-ring cyclodextrins，In Cyclodextrins and their complexes[M].Weinheim：Wiley-VCH，2006：370-380.

[2]Furuishi T，Endo T，Nagase H，et al.Solubilization of C70 into water by complexation with δ -cyclodextrin[J].Chemical Pharmaceutical Bulletin，1998，46：1658-1659.

[3]Miyazawa I，Ueda H，Nagase H，et al.Physicochemical and inclusion complex production of δ -cyclodextrin[J].European Journal of Pharmaceutical Sciences，1995，3：153-162.

[4]Takeshi T，Molecular Y，Shigetaka O，et al.Disproportionating Enzyme（4-α-Glucanotransfera-se；EC 2.4.1.25）of Potato[J].The Journal of Biological Chemistry，1993，268：1391-1396.

[5]Miyazawa I，Ueda H，Nagase H，et al.Physicochemical and inclusion complex production of δ -cyclodextrin[J].European Journal of Pharmaceutical Sciences，1995，3：153-162.

[6]Wang J，Ji X，Jin Z，et al.Effects of fermentation conditions on the production of 4-α-glucanotransferase from recombinant Escherichia coli[J].African Journal of Biotechnology，2011，10（76）：17519-17531.

[7]郭光輝，王金鵬，唐濤，等.產大環(huán)糊精制備條件優(yōu)化[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2011，37（5）：73-78.GUO Guang-hui，WANG Jin-peng，TANG Tao，et al.Optimization of the preparation of LR-CD[J].Food and Fermentation Industries，2011，37（5）：73-78.（in Chinese）

[8]王金鵬.4α糖基轉移酶環(huán)化活性定向控制及其大環(huán)糊精產物的分離及應用研究[D].無錫：江南大學，2011.

[9]張雨薇，楊雪鵬，魏東芝，等.生物電化學法轉化甘油生產1，3-二羥基丙酮[J].食品生物技術學報，2012，3（31）：266-270.ZHANG Yu-wei，YANG Xue-peng，WEI Dong-zhi，et al.Bio-electrochemical synthesis of 1，3-dihydroxyacetone from glycerol[J].Journal of Food Science and Biotechnology，2012，3（31）：266-270.（in Chinese）