喻建平 徐衛(wèi)東，2△ 張艷珍 陳國忠 薛燕風

1江西中醫(yī)學院附屬醫(yī)院，南昌 330006

2中國中醫(yī)科學院臨床基礎醫(yī)學研究所，北京 100070

·實驗研究·

健脾活血補腎湯對CIA大鼠血清IL-17及OPG/RANKL表達的影響*

喻建平1徐衛(wèi)東1，2△張艷珍1陳國忠1薛燕風1

1江西中醫(yī)學院附屬醫(yī)院，南昌 330006

2中國中醫(yī)科學院臨床基礎醫(yī)學研究所，北京 100070

目的通過觀察健脾活血補腎湯對關節(jié)炎(collagen induced arthritis，CIA)模型大鼠血清中炎性細胞因子白細胞介素-17(interleukin-17，IL-17)、骨保護蛋白(osteoprotegerin，OPG)及核因子κB受體活化因子配體(receptor activator for nuclear factor-κB ligand，RANKL)表達水平的影響，探索健脾活血補腎湯保護強直性脊柱炎關節(jié)骨質破壞潛在的分子藥理機制。方法利用弗氏完全佐劑和牛Ⅱ型膠原建立大鼠關節(jié)炎(CIA)模型，自造模成功后第3天起分別按健脾活血補腎湯高、中、低劑量給藥組及生理鹽水給予大鼠灌胃處理，每天1次，連續(xù)灌胃30 d，處死大鼠，心臟采血取血清，用ELISA夾心法檢測大鼠血清中IL-17、OPG及RANKL表達水平。結果健脾活血補腎湯高、中、低各劑量組CIA大鼠血清IL-17及RANKL水平均較模型組明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(Plt;0.05)；而OPG水平較模型組顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義(Plt;0.05)。結論健脾活血補腎湯可能通過降低CIA模型大鼠血清中IL-17及RANKL表達水平，升高OPG表達水平，而起到延緩關節(jié)炎性損傷所致的骨質破壞的作用。

CIA模型大鼠； 健脾活血補腎湯； 白細胞介素-17； 骨保護蛋白； 核因子κB受體活化因子配體

強直性脊柱炎(ankylosing spondylitis，AS)是脊柱關節(jié)病的一種亞型，主要累及骶髂關節(jié)和中軸骨骼，好發(fā)于青少年，通常在18～22歲發(fā)病，男女比例約為2∶1。其特征是持續(xù)性炎癥高度活動和低度活動相交替，以致關節(jié)軟骨和骨被侵蝕和破壞，隨后骨質硬化，最終靜止于全脊柱的融合而失去勞動和自主生活能力[1-3]。骶髂關節(jié)邊緣的骨質侵蝕是強直性脊柱炎早期的放射學特點之一，隨病程的進展也會出現(xiàn)不同程度的關節(jié)畸形及骨質侵蝕。一般認為，一旦骨質遭到破壞，則意味著其病理改變進入不可逆期，因此延緩甚至阻斷AS患者的骨質侵蝕成為AS治療的重要靶標之一?，F(xiàn)有研究[4-6]表明，白細胞介素-17(interleukin-17，IL-17)及成骨、破骨細胞的不平衡對 AS 病情進展起到?jīng)Q定性的作用，并且骨保護蛋白(osteoprotegerin，OPG)系統(tǒng)尤其是 OPG/核因子κB受體活化因子配體(receptor activator for nuclear factor-κB ligand，RANKL)引發(fā)的保護性反應與成骨、破骨細胞不平衡的關系密切。目前，本病主要治療藥物如非甾體抗炎藥、慢作用抗風濕藥和糖皮質激素及生物制劑等，雖有一定臨床療效，但在保護骨質破壞方面的療效尚不十分肯定[7]。健脾活血補腎湯是本科用于治療強直性脊柱炎的經(jīng)驗方，由穿山龍、雞血藤、徐長卿等中藥組成，其主要功效為祛風除濕、益氣健脾、活血通絡和補益肝腎。經(jīng)過長期臨床觀察證實，健脾活血補腎湯能夠在較短的時間內(nèi)緩解疼痛，控制病情，經(jīng)過較長時間的治療后，還具有一定的保護強直性脊柱炎骨質破壞的功效，且長期應用毒副作用也較輕微，但其具體分子作用機制還不清楚[8]。Ⅱ型膠原誘導的關節(jié)炎(collagen induced arthritis,CIA)模型鼠膝關節(jié)局部IL-17高表達可破壞OPG/RANKL平衡，促進骨侵蝕，加重關節(jié)破壞，OPG全身治療可阻止這種關節(jié)破壞[9]。CIA模型鼠早期應用抗體中和內(nèi)源性IL-17后，滑膜細胞RANKL的 mRNA水平顯著降低，骨侵蝕破壞明顯抑制[10]。因此，本實驗觀察了健脾活血補腎湯對CIA大鼠血清IL-17及OPG/RANKL的影響，以探索其保護關節(jié)炎性損傷所致的骨質破壞潛在的分子藥理機制,現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及試劑

Wistar大鼠60 只，清潔級動物，雌雄各半，4～6周齡，體重為(160±15) g，購于江西中醫(yī)學院實驗動物科技中心，許可證號為SCXK(贛)2003-0003。減毒卡介苗(長春生物制品研究所產(chǎn)品)；羊毛脂(中國嘉定華亭羊毛脂廠產(chǎn)品)；牛Ⅱ型膠原(typeⅡcollagen，CⅡ，美國Sigma 公司產(chǎn)品)。檢測大鼠血清中OPG、RANKL及IL-17 ELISA 試劑盒(購自北京義翹神州生物技術有限公司)。

健脾活血補腎湯主要由穿山龍30 g，雞血藤30 g，徐長卿15 g，鬼箭羽15 g等藥組成，由江西中醫(yī)學院附屬醫(yī)院藥劑科制劑室制成為棕褐色藥液(批號：2008102912875)，每100 ml含中藥生藥360 g。根據(jù)臨床用藥劑量及新藥研究中動物用藥劑量要求，采用高劑量標準，即相當于臨床劑量的20倍，計算出大鼠用藥劑量為9.6 g/kg。

1.2 實驗儀器

超凈工作臺(蘇州凈化設備廠)、高速低溫離心機(Eppendorf公司)、S648型電熱恒溫水浴箱(德國)、低溫冰箱(4 ℃～-20 ℃，韓國LG公司)。

1.3 動物造模與分組

大鼠入實驗室后適應性飼養(yǎng)1周，用隨機數(shù)字表對樣本進行隨機化處理，并分為對照組、模型組、低劑量給藥組、中劑量給藥組、高劑量給藥組共5組，每組雌雄大鼠各半。飼養(yǎng)于無毒塑料鼠籠內(nèi)，每籠3～4只。自由飲水進食，喂養(yǎng)全價飼料，自然光照，室內(nèi)溫度保持在(22±1) ℃，相對濕度維持在40％～60％。

造模方法如下：將液體石蠟和羊毛脂(2∶1)于70 ℃水浴中充分混勻，高壓滅菌(121 ℃、30 min)制成弗氏不完全佐劑，4 ℃保存。使用時將減毒卡介苗80 ℃ 滅活，與弗氏不完全佐劑混勻，制成弗氏完全佐劑，卡介苗的終濃度為10 mg/ml。將牛CⅡ溶于0.05 mol/L乙酸，并與等體積弗氏完全佐劑混合制成混懸乳劑，CⅡ終濃度為2 mg/ml。造模大鼠每只尾根部皮內(nèi)注射200 μl上述乳劑，1周后，每只大鼠接受加強免疫，尾根部皮內(nèi)注射乳化CⅡ100 μl，誘發(fā)CIA。對照組大鼠以相同劑量相同部位注射生理鹽水。自造模成功后第3天起分別按健脾活血補腎湯高、中、低劑量給藥組及生理鹽水給予大鼠灌胃處理，每天1次，連續(xù)灌胃30 d。

1.4 關節(jié)炎癥指數(shù)評定

采用關節(jié)分數(shù)評分法記錄多發(fā)性關節(jié)炎病變的發(fā)生及嚴重程度，關節(jié)炎癥的嚴重程度按照以下評分標準進行，分數(shù)越高，病情越重。每個肢體最高分為4分，每只大鼠最高分為16分，記分標準分5級(0～4)，具體標準如下：0分為無關節(jié)炎；1 分為關節(jié)輕度腫脹；2分為關節(jié)部位中度腫脹；3分為嚴重腫脹；4 分為嚴重腫脹且不能負重。

1.5 各組大鼠血清IL-17、OPG及RANKL水平的檢測

各組大鼠分別心臟采血，離心取上清，-20 ℃ 保存?zhèn)溆谩z測血清IL-17、OPG及RANKL 水平，具體操作嚴格按ELISA 試劑盒說明進行。

1.6 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 一般觀察

正常對照組大鼠后腿，可觀察到其表面顯現(xiàn)正常的粉紅色，腳踝無腫脹，足趾不增厚。在免疫8～12 d 后，模型組大鼠開始出現(xiàn)癥狀，發(fā)病大鼠后腿可見腳踝明顯腫脹，足趾明顯增厚，整個后腳呈現(xiàn)紅色或粉紅色斑點，嚴重者可見紫色，且行走不便，不能負重。紅腫逐漸消退出現(xiàn)關節(jié)強直、畸形以至功能障礙，表明慢性、對稱性、多發(fā)性關節(jié)炎發(fā)生。48只免疫大鼠組中，有32 只發(fā)病明顯；而對照組無發(fā)病大鼠。發(fā)病大鼠活動量明顯減少，食欲下降，體重低于正常對照組。

2.2 CIA大鼠關節(jié)炎癥指數(shù)評定

造模成功的CIA大鼠關節(jié)炎癥指數(shù)與正常對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義(Plt;0.05)。關節(jié)炎癥指數(shù)隨時間延長逐漸增高，免疫3周及4周后較免疫10 d后關節(jié)炎癥更明顯，差異具有統(tǒng)計學意義(Plt;0.05)。見表1。

2.3 CIA大鼠血清IL-17、OPG及RANKL 水平與炎癥指數(shù)的相關性分析

免疫4 周后，造模成功CIA大鼠血清IL-17、RANKL 水平與其炎癥指數(shù)呈正相關關系(r=0.569，r=0.482，均Plt;0.05)。與之相反，CIA 大鼠血清OPG 水平與炎癥指數(shù)呈負相關關系(r=-0.491，Plt;0.05)。

表1 大鼠關節(jié)炎癥指數(shù)的比較

與對照組相比*Plt;0.05

2.4 健脾活血補腎湯對CIA大鼠血清IL-17、OPG及RANKL水平的影響

采用雙抗體夾心ELISA法檢測大鼠血清中IL-17、OPG 和 RANKL水平。結果表明，模型組大鼠血清IL-17和RANKL水平均較對照組明顯增高，二者相比差異有統(tǒng)計學意義(Plt;0.05)。由此可見，牛Ⅱ型膠原導致大鼠關節(jié)軟骨損傷時，也刺激機體產(chǎn)生了大量的細胞因子，但其具體因果關系還需進一步的研究。而健脾活血補腎湯高、中、低劑量組大鼠血清IL-17及RANKL水平均較模型組明顯降低(Plt;0.05)；而OPG水平均較模型組顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義(Plt;0.05)，但OPG/RANKL與模型組比較，差異無統(tǒng)計學意義(Pgt;0.05)。見表2-3。

表2 各組大鼠血清IL-17水平的比較

與對照組相比*Plt;0.05，與模型組相比△Plt;0.05

表3 各組大鼠血清OPG及RANKL的水平比較

與對照組相比*Plt;0.05，與模型組相比△Plt;0.05

3 討論

IL-17是一種強大的前炎癥細胞因子，也是炎癥反應的微調因子，可上調軟骨細胞及滑膜成纖維細胞基質金屬蛋白酶的表達，增強軟骨細胞及滑膜成纖維細胞基質金屬蛋白酶(MMP-1，3，13 )表達，促進軟骨蛋白多糖及膠原降解[11]，抑制軟骨細胞蛋白多糖的合成[12]，并可增強單核細胞對軟骨基質的破壞。同時其亦可誘導RANKL表達，破壞OPG/RANKL平衡，誘導破骨細胞祖細胞向成熟破骨細胞分化，增強了關節(jié)膠原破壞和重建，骨質破壞以及軟骨破壞，并可能在將急性滑膜炎轉變?yōu)槁云茐男躁P節(jié)炎中起關鍵作用[13-16]。RANKL、NF-κB受體活化因子RANK及OPG系統(tǒng)是新近發(fā)現(xiàn)的一組調控破骨細胞分化的細胞因子，大量研究[17-19，9]表明RANKL/RANK/OPG系統(tǒng)在AS的骨質侵蝕中扮演重要角色，可能是治療的靶點之一，OPG具有廣泛的組織分布，在骨骼中的OPG主要由成骨細胞譜系的各種細胞產(chǎn)生，它是一種誘餌受體，其作用是結合或中和可溶性RANKL及與成骨細胞/基質細胞結合的RANKL，或中和其他TNF配基家族成員，從而阻斷RANKL與RANK的結合，抑制破骨細胞前體的分化和成熟，并誘導破骨細胞凋亡。動物實驗[16]結果也初步顯示，在關節(jié)炎早期階段，用IL-17中和性抗體治療可以顯著減輕關節(jié)炎的嚴重程度，X線片示關節(jié)損傷被明顯抑制；組化分析也證實IL-l7抗體抑制關節(jié)炎癥，阻止關節(jié)軟骨和骨的進一步破壞。

由于當前制備強直性脊柱炎動物模型的實驗技術還不成熟，而有證據(jù)表明，Ⅱ型膠原誘導的關節(jié)炎鼠模型膝關節(jié)局部IL-17高表達可破壞OPG/RANKL平衡，促進骨侵蝕，加重關節(jié)破壞，故本研究借此動物模型來探索健脾活血補腎湯治療強直性脊柱炎骨質破壞的分子藥理機制[5]。本實驗發(fā)現(xiàn)，Ⅱ型膠原誘導CIA模型大鼠血清中致炎因子IL-17及RANKL明顯升高，抑炎因子OPG 表達顯著受抑，并且增高的IL-17及RANKL與炎癥指數(shù)呈正相關關系，而降低的OPG水平與炎癥指數(shù)呈負相關，說明關節(jié)炎大鼠發(fā)病過程中，細胞因子網(wǎng)絡失調發(fā)揮重要作用，并與炎癥發(fā)病有關。

本研究還發(fā)現(xiàn)，健脾活血補腎湯各給藥組大鼠血清中致炎因子IL-17 及RANKL均較CIA模型大鼠明顯降低，而抑炎因子OPG 表達顯著升高，表明健脾活血補腎湯能通過降低致炎因子IL-17 及RANKL的表達，升高抑炎因子OPG的表達，而起到延緩炎性關節(jié)的骨質侵襲和破壞的作用。但是由于本模型不是強直性脊柱炎的經(jīng)典模型，故其在保護強直性脊柱炎骨質破壞方面的機制，還有待于其它動物模型成熟后，開展更進一步的研究。

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EffectsofIntensifyingKidneyandSpleenandActivatingBloodCirculationDecoctionontheExpressofIL-17andOPG/RANKLinSerumofCIARat

YU Jianping1，XU Weidong1，2，ZHANG Yanzhen1，et al

1AffiliatedHospitalofJiangxiCollegeofTraditionalChineseMedicine，Nanchang330006，China

2InsitituteofBasicResearchinClinicalMedicine，ChinaAcademyofChineseMedicalScience，Dongzhimen，Beijing100700，China

ObjectiveTo explore the effects of intensifying kidney and spleen and activating blood circulation decoction on the express of IL-17 and OPG/RANKL in serum of CIA rat.MethodsThe CIA rat model was induced by intradermal of CFA and typeⅡcollagen.A total of 60 Wistar rats were divided into 5 groups randomly，three treatment groups which were given high，medium and low concentration of intensifying kidney and spleen and activating blood circulation decoction respectively，control group which was given normal saline and CIA mode group.After being lavaged for 30 days，the level of IL-17，OPG and RANKL in serum was determined by ELISA kits.ResultsCompared with the model group，the level of IL-17 and RANKL in rat serum of three treatment groups decreased significantly(Plt;0.05)，whereas the serum level of OPG in three treatment groups increased markedly(Plt;0.05).ConclusionThe intensifying kidney and spleen and activating blood circulation decoction could postpone joint bone inflammatory damage through reducing the serum levels of IL-17 and RANKL and increasing the serum level of OPG in the of CIA model rat.

CIA model rats；intensifying kidney and spleen and activating blood circulation decoction；IL-17；OPG；RANKL

10.3969/j.issn.1674-4616.2013.05.004

*國家自然科學基金資助項目(No.81060291/H2708)

△通信作者，Corresponding author，E-mail：jindadong169@163.com

2013-05-11