楊 光，楊 宇，曾憲陽

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一［1］。全世界每年約有120 萬婦女患乳腺癌，50 萬婦女死于乳腺癌，其發(fā)病率在世界范圍內(nèi)呈明顯上升趨勢(shì)。全球范圍內(nèi)，北美和歐洲地區(qū)是乳腺癌高發(fā)區(qū)，其總體趨勢(shì)為發(fā)達(dá)國(guó)家明顯高于發(fā)展中國(guó)家。我國(guó)屬于乳腺癌低發(fā)國(guó)家，但近年來沿海大城市的發(fā)病率及病死率都有所升高。目前乳腺癌的治療已從原始簡(jiǎn)單的手術(shù)切除發(fā)展到現(xiàn)代的綜合全身治療，患者生存率已顯著提高。在現(xiàn)代乳腺癌臨床治療中，化療起到重要作用［2］。以阿霉素(ADM)為代表的蒽環(huán)類抗生素，是乳腺癌的重要化療藥物。然而，近年來研究表明ADM 在乳腺癌治療中的耐藥現(xiàn)象經(jīng)常出現(xiàn)，這嚴(yán)重束縛了ADM 在臨床上的應(yīng)用［3］。因此，尋找與ADM 有互補(bǔ)作用的藥物和其聯(lián)用，可以為治療乳腺癌提供重要方法。姜黃素已被證明可以敏化多種化療藥物［4］，然而姜黃素是否可以敏化ADM治療乳腺癌還鮮有報(bào)道，本研究擬在觀察姜黃素與ADM 聯(lián)合對(duì)人乳腺癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響，探討兩者之間的相互作用關(guān)系，以期為臨床聯(lián)合用藥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 人乳腺癌MCF-7 細(xì)胞及MDA-MB-231 細(xì)胞購于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤細(xì)胞庫;RPMI1640 培養(yǎng)液和小牛血清購于GIBCO 公司;姜黃素，ADM 和噻唑藍(lán)(MTT)購于美國(guó)Sigma 公司，其中姜黃素和ADM 用二甲基亞砜(DMSO)溶解，-20℃保存，臨用前解凍，用RPMI1640 培養(yǎng)液稀釋到所需濃度，使DMSO 的終濃度為＜0.1%;多功能酶標(biāo)儀(Molecular Devices)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及藥物處理 人乳腺癌MCF-7 細(xì)胞及MDA-MB-231 細(xì)胞在含有10%的胎牛血清的RPMI1640 培養(yǎng)液中培養(yǎng)，并置于37℃、5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)備用。細(xì)胞按(2～5)×105接種于培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。姜黃素和ADM 以DMSO稀釋為1 mmol/L 置4℃冰箱保存，用時(shí)稀釋成工作濃度。工作濃度為0.1、1、10 和100 μmol/L。

1.3 方法

1.3.1 MTT 法檢測(cè)細(xì)胞的增殖能力 用0.25%的胰蛋白酶消化對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MCF-7 細(xì)胞及MDA-MB-231 細(xì)胞，以適當(dāng)密度接種于96 孔板內(nèi)。細(xì)胞鋪板24 h 后，加藥處理，每張板設(shè)空白對(duì)照組。細(xì)胞加藥后繼續(xù)培養(yǎng)48 h，藥物作用完畢，向各孔加入MTT 溶液，使細(xì)胞與0.25%(mg/ml)MTT在5% CO2的37℃培養(yǎng)箱中共同孵育3～4 h，吸除培養(yǎng)液，然后每孔加入100 μl 的DMSO 溶解5～10min，結(jié)晶振蕩溶解后使用酶標(biāo)儀于492 nm 處測(cè)其光密度值，計(jì)算IC50值。

1.3.2 藥物合用研究及計(jì)算 根據(jù)1.3 得到的兩藥對(duì)MCF-7 細(xì)胞及MDA-MB-231 細(xì)胞抑制的IC50值，然后根據(jù)姜黃素:ADM(20∶1)濃度比例聯(lián)合應(yīng)用，藥物共處理48 h 后，采用CalcuSyn(Biosoft，Oxford，UK)藥物合用指數(shù)計(jì)算軟件進(jìn)行分析，計(jì)算聯(lián)合指數(shù)(CI)，CI 小于0.9 表示兩藥為協(xié)同作用;CI 在0.9～1.1 表示兩藥為相加作用;CI 大于1.1表示兩藥為拮抗作用。

1.3.3 Western blot 檢測(cè)蛋白表達(dá) 收集經(jīng)藥物作用的細(xì)胞，加入100 μl 蛋白裂解液，-20℃放置20 min，13 000 r/min 離心5 min，收集上清，Bradford 法檢測(cè)蛋白濃度。核蛋白和漿蛋白提取采用Thermo Scientific NE-PER 核蛋白和胞質(zhì)蛋白提取試劑盒。隨后SDS-PAGE 電泳，在250 mA、1 h 的條件下將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，以015 g/L 脫脂奶粉TBST液封閉后用PARP、Bcl-2、Bax、NF-κB(p65)和β-actin抗體(1∶400)4℃孵育過夜，洗滌后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗孵2 h，ECL 法顯影。

2 結(jié) 果

2.1 對(duì)MCF-7 及MDA-MB-231 生長(zhǎng)的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，姜黃素和ADM 聯(lián)合后，對(duì)MCF-7細(xì)胞和MDA-MB-231 細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用比兩藥單用明顯。用CalcuSyn 軟件分析得出，對(duì)MCF-7 細(xì)胞，合用組ED50CI=0.7(圖1 A)，對(duì)MDA-MB-231 細(xì)胞，合用組ED50CI=0.62(圖1 B)。上述結(jié)果說明，姜黃素與ADM 兩藥合用具有協(xié)同抑制乳腺癌細(xì)胞MCF-7 和MDA-MB-231 生長(zhǎng)的作用。

圖1 姜黃素聯(lián)合ADM 對(duì)乳腺癌細(xì)胞MCF-7和MDA-MB-231 生長(zhǎng)的影響

2.2 對(duì)MCF-7 凋亡相關(guān)蛋白的影響 結(jié)果表明，姜黃素(10 μmol/L)單用及ADM 單用(0.5 μmol/L)48 h 后都可以增加MCF-7 細(xì)胞的PARP 蛋白裂解，而兩藥合用后PARP 蛋白裂解明顯增強(qiáng)(圖2)，這提示其協(xié)同作用可能是通過誘導(dǎo)凋亡實(shí)現(xiàn)的。此外，筆者還檢測(cè)了凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2 和Bax，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明兩藥單用及合用對(duì)MCF-7 細(xì)胞Bax 蛋白表達(dá)無明顯影響，但姜黃素單用及合用后可以明顯抑制MCF-7 細(xì)胞Bcl-2 蛋白的表達(dá)(圖2)，這說明其協(xié)同作用可能與抑制Bcl-2 蛋白表達(dá)相關(guān)。

圖2 姜黃素聯(lián)合ADM 對(duì)乳腺癌細(xì)胞MCF-7 凋亡相關(guān)蛋白的影響

2.3 對(duì)MCF-7 的NF-κB 信號(hào)通路的影響ADM 單用可使MCF-7 細(xì)胞核內(nèi)的p65 表達(dá)增多，胞漿內(nèi)的p65 表達(dá)減少(圖3)，這說明ADM 單用可以促進(jìn)NF-κB 信號(hào)激活。而姜黃素單用及與ADM 聯(lián)合可使MCF-7 細(xì)胞核內(nèi)的p65 表達(dá)減少，胞漿內(nèi)的p65 表達(dá)相對(duì)增加(圖3)，這說明姜黃素能夠抑制ADM 所引起的NF-κB 信號(hào)激活。

圖3 姜黃素聯(lián)合ADM 對(duì)乳腺癌MCF-7 細(xì)胞NF-κB 通路的影響

3 討 論

以ADM為代表的蒽環(huán)類抗生素，是乳腺癌的重要化療藥物。ADM 可以嵌入DNA，抑制DNA 合成。拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ在轉(zhuǎn)錄過程中使DNA 解旋，ADM可抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ的形成。破壞DNA 鏈后，ADM穩(wěn)定拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ的合成，防止DNA 雙螺旋再次結(jié)合，從而停止復(fù)制。此外，ADM 還通過減少抗腫瘤蛋白的表達(dá)水平而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。然而，有報(bào)道顯示，近年來ADM 在腫瘤治療中的耐藥現(xiàn)象經(jīng)常出現(xiàn)。腫瘤細(xì)胞對(duì)ADM 耐藥的機(jī)制包括P-糖蛋白和Bcl-2 的向上調(diào)節(jié)和改變拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ的活性。近期研究表明，NF-κB 可以抑制ADM 誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞凋亡，并增加其耐藥［5］。因此，尋找與ADM 有互補(bǔ)作用的藥物和其聯(lián)用，可以為治療乳腺癌提供重要方法。姜黃素是從姜黃科自主的根莖姜黃中提取的一種自主多酚，具有抗炎、抗氧化、抗凝、抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗腫瘤等藥理作用，對(duì)多種腫瘤有抑制作用，且可以敏化多種化療藥物，是一種理想的抗腫瘤輔助藥物。誘導(dǎo)凋亡，周期阻滯和阻斷NFκB 信號(hào)通路被認(rèn)為是姜黃素抗腫瘤的潛在機(jī)制［6］。本研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素與ADM 兩藥合用對(duì)乳腺癌細(xì)胞MCF-7 和MDA-MB-231 生長(zhǎng)抑制作用半數(shù)有效聯(lián)合指數(shù)(EC50CI)分別為0.7 和0.6，這說明兩藥合用具有協(xié)同抑制，提示姜黃素有可能成為ADM 理想化療輔助用藥。

細(xì)胞凋亡是一種由基因控制的細(xì)胞自主死亡方式，而凋亡抵抗被認(rèn)為是腫瘤細(xì)胞的一個(gè)重要特征。在眾多凋亡標(biāo)志物中，聚ADP 核糖聚合酶(poly-ADP-ribos polymerase，PARP)裂解一致被認(rèn)為是一個(gè)重要的凋亡觀測(cè)指標(biāo)。本研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素聯(lián)合ADM 可以增強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞MCF-7 的PARP 蛋白裂解，說明其協(xié)同抗腫瘤作用是通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡而實(shí)現(xiàn)的。Bcl-2 被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡蛋白家族中最重要的調(diào)控蛋白，和Bax、Bad、Bak 等共同組成了Bcl-2 蛋白家族，Bcl-2 的功能受其蛋白產(chǎn)物Bax 蛋白調(diào)節(jié)。Bcl-2 家族成員主要定位在核膜的胞質(zhì)面、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及線粒體外膜上，與膜的結(jié)合對(duì)于其發(fā)揮功能是極其重要的。研究顯示，Bcl-2 可以穩(wěn)定細(xì)胞線粒體膜電位，從而抑制細(xì)胞凋亡，被認(rèn)為是一個(gè)重要的抗腫瘤靶點(diǎn)，同時(shí)也是腫瘤耐藥的一個(gè)重要機(jī)制［7］。本研究結(jié)果表明，姜黃素聯(lián)合ADM可以明顯抑制Bcl-2 蛋白的表達(dá)，這暗示兩藥合用可能通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生線粒體依賴途徑的凋亡，說明Bcl-2 可能是姜黃素協(xié)同ADM 抑制乳腺癌細(xì)胞的作用靶點(diǎn)之一。

化學(xué)耐藥是腫瘤治療中的一種常見現(xiàn)象。經(jīng)過一定時(shí)期的化學(xué)治療后，腫瘤患者常常會(huì)復(fù)發(fā)。很多抗腫瘤藥物，不僅是包括ADM 和柔紅霉素在內(nèi)的蒽環(huán)類抗生素，還有紫杉醇和長(zhǎng)春堿類，均可以通過激活細(xì)胞內(nèi)的NF-κB 誘導(dǎo)化學(xué)耐藥產(chǎn)生。這些抗腫瘤藥物可以使NF-κB 磷酸化，從而導(dǎo)致其蛋白降解，促進(jìn)NF-κB 的兩個(gè)亞基p65 和p50 從胞漿轉(zhuǎn)移到胞核，激活它們的靶蛋白，此靶基因可誘導(dǎo)化學(xué)耐藥。很多報(bào)道表明，抑制NF-κB 通路可以提高腫瘤化學(xué)治療的效果［8］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，姜黃素幾乎完全抑制了ADM 誘導(dǎo)的NF-κB 激活。此外，NF-κB 的靶蛋白Bcl-2，在兩藥聯(lián)用時(shí)這兩種蛋白均被下調(diào)。因此，抑制NF-κB 通路，從而減少ADM 耐藥是兩藥在體外協(xié)同作用的機(jī)制之一。綜上所述，姜黃素與ADM 聯(lián)合應(yīng)用具有協(xié)同的抗乳腺癌生長(zhǎng)作用，其作用機(jī)制與抑制ADM 誘導(dǎo)的NF-κB 激活繼而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡有關(guān)。

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