陳 景， 黃曙方， 肖定璋， 麥麗萍， 彭 琪， 賴(lài)沛龍， 陳少賢， 余細(xì)勇

(廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院，廣東省人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)研究中心，廣東廣州510080)

丹參酮ⅡA磺酸鈉(tanshinoneⅡA，TSⅡA)是從唇形科植物丹參(Salvia miltiorrhiza)中分離二萜醌類(lèi)化合物丹參酮ⅡA，經(jīng)磺化而得到的水溶性物質(zhì)，是中藥丹參主要有效成分之一。近年研究發(fā)現(xiàn)，TSⅡA對(duì)肝癌、胃癌等多種腫瘤細(xì)胞具有顯著的抑制生長(zhǎng)增殖及殺傷作用［1-2］。目前研究顯示細(xì)胞周期可影響細(xì)胞生長(zhǎng)增殖，細(xì)胞周期調(diào)控因子將參與細(xì)胞生長(zhǎng)增殖途徑，其中cyclin A、cyclin D2等在促細(xì)胞生長(zhǎng)增殖中扮演重要角色。我們既往的研究表明通過(guò)藥物下調(diào)細(xì)胞周期蛋白cyclin D1可顯著抑制細(xì)胞生長(zhǎng)增殖［3］，為進(jìn)一步闡明TSⅡA抑制細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的機(jī)制，本研究以不同濃度的TSⅡA作用于胰腺癌BX-PC-3細(xì)胞系，觀察TSⅡA抑制 BX-PC-3細(xì)胞生長(zhǎng)增殖過(guò)程中cyclin A和cyclin D2的變化情況。

材料和方法

1 材料

人胰腺癌細(xì)胞株BX-PC-3購(gòu)于中科院上海細(xì)胞研究所;TSⅡA購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所，純度≥98%(批號(hào):111605-200301);Gibco新生胎牛血清購(gòu)于英韋創(chuàng)津公司;HyClone DMEM/F12培養(yǎng)基和0.25%胰蛋白酶溶液均購(gòu)于萊德?tīng)柟?MTT試劑為南京凱基生物公司產(chǎn)品;DAPI試劑盒(Nuclear I-solation and Staining Solution-10;NPE Systems Inc.)，Cell Cycle Staining Solution［MultiSciences;主要成分:碘化丙啶(propidium iodide，PI)50 mmol/L，RNaseA 200 mg/L，四鹽酸精胺1 g/L］;兔多克隆cyclin A和cyclin D2抗體購(gòu)于武漢博士德公司;GAPDH單克隆抗體購(gòu)于上?？党晒?，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記小鼠IgG及兔IgGⅡ抗購(gòu)于Santa Cruz;Super ECL Plus購(gòu)于北京普利萊公司;DMSO試劑購(gòu)于Sigma，其它均為分析純?cè)噭?/p>

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人胰腺癌細(xì)胞株BX-PC-3培養(yǎng)于含10%胎牛血清DMEM/F12培養(yǎng)基中，37℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)，每3 d換液傳代培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)細(xì)胞起始接種濃度為1×107/L。

2.2 藥物處理及實(shí)驗(yàn)分組 稱(chēng)取2 mg TSⅡA溶解于1 mL 0.02%二甲基亞砜 (dimethyl sulfoxide，DMSO;一般認(rèn)為DMSO＜0.1%時(shí)，不引起細(xì)胞生物學(xué)性狀的改變)，使其濃度為2 g/L，過(guò)濾除菌保存，臨用時(shí)以適量的培養(yǎng)液稀釋到實(shí)驗(yàn)所需濃度。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果及文獻(xiàn)報(bào)道，設(shè)5個(gè)實(shí)驗(yàn)組，各組濃度分別為 0、10、20、30、40 和 50 mg/L，其中 0 mg/L 為空白對(duì)照組，其余為干預(yù)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組。

2.3 MTT法測(cè)定TSⅡA對(duì)人胰腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人胰腺癌BX-PC-3細(xì)胞，制成1×108/L的單細(xì)胞懸液后以每孔100 μL接種于96孔板，在5%CO2、飽和濕度、37℃孵箱中預(yù)培養(yǎng)24 h后加入不同體積的TSⅡA，使最終每組含TSⅡA 濃度分別為10、20、30、40、50 mg/L，每個(gè)劑量分別設(shè)3個(gè)復(fù)孔，并設(shè)正常細(xì)胞作對(duì)照組，繼續(xù)培養(yǎng)。于48 h進(jìn)行MTT比色實(shí)驗(yàn):每次于實(shí)驗(yàn)結(jié)束前每孔加入濃度為5 g/L MTT液50 μL，37℃避光培養(yǎng)繼續(xù)培養(yǎng)4 h，使MTT還原為formazan。每孔加DMSO 100 μL，避光搖勻10 min，使formazan充分溶解，后置于酶標(biāo)儀570 nm檢測(cè)吸光度(absorbance，A)值，以空白組平均值調(diào)零，根據(jù)吸光度計(jì)算不同濃度的TSⅡA對(duì)胰腺癌細(xì)胞的增殖抑制率(inhibitory rate，IR)。IR(%)=(對(duì)照組A值－藥物作用組A值)/(對(duì)照組A值－本底對(duì)照組A值)×100%。評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn):IR＞70%為高度敏感，IR在50% ～70%之間為中度敏感，IR在30% ～50%之間為低度敏感，IR＜30%為不敏感。

2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期 生長(zhǎng)狀態(tài)良好的BX-PC-3細(xì)胞換無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h，設(shè)10、20、30、40、50 mg/L 5個(gè)給藥濃度，分別加入不同體積的TSⅡA，另設(shè)空白血清對(duì)照組，培養(yǎng) 48 h后，經(jīng)0.25%胰酶消化，分別收集細(xì)胞于15 mL離心管中，每份細(xì)胞密度約1×109/L，PBS洗2次，2 000 r/min離心5 min棄上清液。每份細(xì)胞加入1 mL DAPI染液，室溫避光染色2 min以上，300目篩網(wǎng)過(guò)濾后上機(jī)進(jìn)行檢測(cè)。通過(guò)調(diào)節(jié)電壓在EV直方圖中顯示BX-PC-3細(xì)胞的細(xì)胞主群，設(shè)門(mén)(EV)圈住主群細(xì)胞，在FL1直方圖中顯示EV門(mén)中細(xì)胞群，將二倍體熒光峰G0/G1峰調(diào)至熒光道數(shù)為200道處，獲取10 000個(gè)細(xì)胞。將QuantaTMSC MPLCollection軟件下獲取的數(shù)據(jù)經(jīng)QuantaTMSC MPLAnalysis軟件以FSC的格式輸出，打開(kāi)細(xì)胞周期分析軟件Muticycle，導(dǎo)入數(shù)據(jù)并擬合，進(jìn)行分析比較。

2.5 Western blotting 將生長(zhǎng)狀態(tài)良好BX-PC-3細(xì)胞平均接種到6孔板中，經(jīng)不同濃度TSⅡA刺激48 h后，將各組細(xì)胞用預(yù)冷的PBS液洗3次，吸棄PBS液，加入預(yù)冷的含抑制劑的細(xì)胞裂解液，輕輕搖動(dòng)5 min后，用一預(yù)冷的細(xì)胞刮刮下培養(yǎng)瓶壁上細(xì)胞，轉(zhuǎn)移細(xì)胞懸液到離心管中，冰浴15 min進(jìn)行裂解.裂解液于4℃、12 000 r/min離心15 min，收集上清。12%SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜，用含5%脫脂奶粉的TTBS(0.1 mol/L Tris-HCl，pH 7.5;0.2%NaCl;0.05%Tween-20)37 ℃封閉1～2 h，分別加入兔抗人cyclin A和cyclin D2多克隆抗體、GAPDH單克隆抗體，4℃孵育過(guò)夜。TTBS漂洗5 min×3次;鼠抗辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記Ⅱ抗(1∶9 000稀釋)或者兔抗辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記Ⅱ抗(1∶9 000稀釋)4℃孵育45 min;TTBS漂洗5 min×3次;Super ECL Plus敏感曝光試劑盒曝光底片顯影。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理。兩樣本均數(shù)間比較采用t檢驗(yàn)，多樣本均數(shù)間比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，組間比較采用Dunnett t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 TSⅡA抑制BX-PC-3細(xì)胞增殖

10、20、30、40、50 mg/L TSⅡA 作用48 h 對(duì)胰腺癌BX-PC-3細(xì)胞的增殖有明顯的抑制作用，其A值明顯低于空白組，見(jiàn)圖1。TSⅡA對(duì)BX-PC-3細(xì)胞株的生長(zhǎng)有抑制作用，細(xì)胞存活率隨TSⅡA濃度升高而降低，抑制效果呈現(xiàn)濃度依賴(lài)性。

Figure 1.Effect of tanshinoneⅡA on BX-PC-3 cell proliferation detected by MTT assay.Mean ± SD.n=3.圖1 不同濃度TSⅡA對(duì)胰腺癌細(xì)胞增殖的抑制

2 TSⅡA對(duì)胰腺癌細(xì)胞BX-PC-3周期的影響

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)顯示，隨著藥物濃度的增加，G0/G1期細(xì)胞逐漸增加，G2/M期細(xì)胞明顯下降，各濃度用藥組與空白對(duì)照相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)圖2。

3 Western blotting結(jié)果

如圖3所示，隨著TSⅡA濃度的增加，cyclin A與cyclin D2的表達(dá)量呈明顯下調(diào)趨勢(shì)。

討 論

胰腺癌是一種惡性程度極高的致死性疾病，具有難發(fā)現(xiàn)、易轉(zhuǎn)移、治療效果極差的特點(diǎn)且目前治療手段有限。近年來(lái)，已經(jīng)證實(shí)中醫(yī)藥治療胰腺癌不僅可以減輕癥狀，還能控制胰腺腫瘤細(xì)胞發(fā)展。其中TSⅡA抗癌作用可能是通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡途徑［4］和介導(dǎo)細(xì)胞周期調(diào)控因子抑制腫瘤細(xì)胞增殖途徑［5］來(lái)實(shí)現(xiàn)，但TSⅡA對(duì)胰腺癌的作用效果如何仍不明確。我們前期研究表明通過(guò)藥物下調(diào)細(xì)胞周期調(diào)控因子cyclin D1可顯著抑制細(xì)胞生長(zhǎng)增殖，本研究表明具有抗腫瘤作用的中藥TSⅡA能夠有效抑制胰腺癌BX-PC-3細(xì)胞增殖，具體機(jī)制可能通過(guò)細(xì)胞周期調(diào)控因子cyclin A和cyclin D2介導(dǎo)。

Figure 2.The effects of tanshinoneⅡA at different concentrations for 48 h on cell cycle of BX-PC-3 cells detected by FCM.Mean ±SD.n=3.*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs control group(0 mg/L).圖2 不同濃度的TSⅡA作用于BX-PC-3細(xì)胞48 h后細(xì)胞周期分布的變化

Figure 3.Cyclin A and cyclin D2 protein expression in BX-PC-3 cells 48 h after treatment with tanshinoneⅡA at different concentrations determined by Western blotting.Mean ± SD.n=3.*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs control group(0 mg/L).圖3 不同濃度的TSⅡA處理48 h后BX-PC-3細(xì)胞cyclin A與cyclin D2的表達(dá)

我們采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同濃度的TSⅡA對(duì)BX-PC-3生長(zhǎng)周期的影響，發(fā)現(xiàn)處于低藥物濃度時(shí)，細(xì)胞停留在G0/G1期的比例與對(duì)照組相比變化不大，但當(dāng)藥物濃度達(dá)到40 mg/L甚至以上時(shí)，細(xì)胞停留在G0/G1期的比例較對(duì)照組明顯升高。而TSⅡA應(yīng)用后，G2/M期比例呈現(xiàn)明顯下降，并且隨著濃度增加，細(xì)胞停留在G2/M期的比例呈現(xiàn)明顯劑量依賴(lài)的下降關(guān)系。正常組織細(xì)胞的周期存在G0/G1期和G2/M期轉(zhuǎn)換2個(gè)限制點(diǎn)，這2個(gè)點(diǎn)使細(xì)胞的增殖與凋亡處于一種微妙的平衡狀態(tài)。而在腫瘤細(xì)胞中，這種平衡狀態(tài)被打破，腫瘤細(xì)胞無(wú)限制地增殖。所以，干擾腫瘤細(xì)胞的周期，使腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)速率減慢，這將從本質(zhì)上達(dá)到抑制腫瘤的效果。本研究結(jié)果提示TSⅡA能阻滯胰腺癌細(xì)胞于G0/G1期，從而達(dá)到抑制細(xì)胞增殖的效果。

Cyclin A是細(xì)胞周期的正性調(diào)控因子，屬于M期周期蛋白，具有調(diào)節(jié)DNA合成和促進(jìn)細(xì)胞有絲分裂的雙重作用［6］。Cyclin A的異常表達(dá)，可直接或間接地促進(jìn)G1/S期轉(zhuǎn)換，啟動(dòng)DNA合成，而引起細(xì)胞異常增殖［7］。Cyclin D2是調(diào)節(jié)G1期的細(xì)胞周期蛋白cyclin D家族的成員之一，與細(xì)胞周期G1/S期轉(zhuǎn)換有關(guān)，主要是啟動(dòng)S期，其異?；虿磺‘?dāng)?shù)谋磉_(dá)可破壞細(xì)胞周期。我們采用Western blotting進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)隨著藥物濃度的增加，細(xì)胞周期調(diào)控因子cyclin A和cyclin D2蛋白合成下降，使細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期，從而抑制細(xì)胞增殖。這一結(jié)果與BXPC-3細(xì)胞生長(zhǎng)阻滯在G0/G1期是一致的。

我們通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，TSⅡA對(duì)胰腺癌細(xì)胞BXPC-3細(xì)胞的生長(zhǎng)具有明顯抑制作用，而且隨著藥物濃度的增加，G0/G1期細(xì)胞逐漸增加，G2/M期細(xì)胞明顯下降，并且cyclin A和cyclin D2的蛋白表達(dá)也隨之明顯下調(diào)，說(shuō)明TSⅡA對(duì)胰腺癌細(xì)胞BX-PC-3細(xì)胞的G2/M期檢查點(diǎn)功能可能是通過(guò)調(diào)控cyclin A和cyclin D2來(lái)完成的。本實(shí)驗(yàn)證明，TSⅡA抑制胰腺癌細(xì)胞增殖的根本機(jī)制可能在于使胰腺癌細(xì)胞阻滯于G0/G1期，抑制細(xì)胞分裂增殖，具有良好的抑制胰腺癌細(xì)胞增殖作用，在治療胰腺癌方面具有較好的應(yīng)用前景。

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