嵇曉輝， 范秉琳， 張紅鴿， 蔡新華， 朱武凌

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河南新鄉(xiāng)453003)

MicroRNAs(miRNAs)是一類(lèi)短小(20～24 nt)的非編碼RNA，通過(guò)影響mRNA的穩(wěn)定性和翻譯而參與多細(xì)胞生物體中基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。MicroRNA-100(miR-100)在人類(lèi)定位于 11q24.1，研究表明它在鼻咽癌、卵巢癌、宮頸癌等多種腫瘤中異常表達(dá)，失去對(duì)靶基因Polo樣激酶1(Polo-like kinase 1，Plk1)的調(diào)控，因而Plk1表達(dá)上調(diào)，這種改變不僅參與癌的發(fā)生過(guò)程，而且可能與腫瘤的進(jìn)展密切相關(guān)［1-3］。目前尚不十分清楚miR-100對(duì)肝癌細(xì)胞的生物學(xué)作用及其分子機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)采用陽(yáng)離子脂質(zhì)體Oligofectamine介導(dǎo)，將人工化學(xué)合成的miR-100模擬物瞬時(shí)轉(zhuǎn)染人肝癌HepG2細(xì)胞中，分析肝癌細(xì)胞的增殖活力、細(xì)胞周期和Plk1的表達(dá)情況，以期能夠揭示miR-100對(duì)肝癌細(xì)胞的作用與機(jī)制。

材料和方法

1 細(xì)胞培養(yǎng)

人肝癌細(xì)胞株HepG2用含10%胎牛血清及1×105U/L青霉素、100 mg/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，選用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。

2 miRNA-100的合成及實(shí)驗(yàn)分組

根據(jù) miR-100的核苷酸序列:5'-AACCCGUAGAUCCGAACUUGUG-3'，由大連寶生物公司合成帶有熒光素Cy3標(biāo)記的miRNA-100模擬物以及陰性對(duì)照，同時(shí)實(shí)驗(yàn)附設(shè)單純脂質(zhì)體對(duì)照。

3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

按照陽(yáng)離子脂質(zhì)體Oligofectamine試劑(Invitrogen)的操作說(shuō)明進(jìn)行，將85 μL培養(yǎng)液Opti-MEM與20 μmol/L miR-100模擬物和陰性對(duì)照各5 μL充分混和，與脂質(zhì)體/Opti-MEM混合物再次混合，將最終混合物加入含新鮮Opti-MEM培養(yǎng)基的肝癌HepG2細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染終濃度為100 nmol/L，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)至24 h、48 h和72 h。

4 細(xì)胞增殖抑制率測(cè)定

細(xì)胞培養(yǎng)于96孔板中，5×103cells/well，培養(yǎng)24 h后進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染后24 h、48 h及72 h，加入細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒8(cell counting kit-8，CCK-8)溶液10 μL后繼續(xù)培養(yǎng)3 h，酶標(biāo)儀檢測(cè)波長(zhǎng)450 nm處各孔吸光度(A)。細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率(%)=(1－實(shí)驗(yàn)孔A值/對(duì)照孔A值)×100% 。

5 流式細(xì)胞術(shù)分析

于4℃、75%乙醇中固定收集細(xì)胞8 h。離心后將細(xì)胞重新懸浮于含有200 mg/L RNA酶及15 mg/L碘化丙啶的PBS中，室溫孵育30 min后，通過(guò)流式細(xì)胞儀(Beckman Coulter)進(jìn)行細(xì)胞周期分析，檢測(cè)重復(fù)3次。細(xì)胞增殖指數(shù)的計(jì)算方法為:(S+G2/M)÷(G0/G1+S+G2/M)。

6 實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)

采用 Trizol試劑(Invitrogen)提取實(shí)驗(yàn)各組HepG2細(xì)胞的總RNA，紫外檢測(cè)儀分別在260 nm和280 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)RNA的濃度及純度。用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa)合成cDNA，以此為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增。Plk1上游引物5'-CCTCTCACAGTCCTTAATAA-3'，下游引物 5'-TGTCCGAATAGTCTACCC-3'。實(shí)驗(yàn)同步以 β-actin作為內(nèi)參照，上游引物5'-CCAAGGCCAACCGCGAGAAGATGAC-3'，下游引物 5'-AGGGTACATGGTGGTGCCGCCAGAC-3'。mRNA表達(dá)量的分析采用比較Ct數(shù)據(jù)法(2－ΔΔCt)進(jìn)行。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

7 Western blotting分析

按蛋白提取試劑盒(Thermo)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行并測(cè)定濃度，取60 μg蛋白進(jìn)行10%聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳完成后將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜。封閉、抗體孵育及顯色按照One-Step Western試劑盒(GenScript)說(shuō)明進(jìn)行，Plk1Ⅰ抗(Abcom)工作濃度為1∶600，結(jié)果采用Quantity One凝膠圖像處理軟件進(jìn)行分析。

8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0軟件包進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染

人工合成Cy3熒光標(biāo)記的miR-100模擬物轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，培養(yǎng)24 h后在激光共聚焦顯微鏡下觀察，可見(jiàn)大部分細(xì)胞內(nèi)有紅色熒光，見(jiàn)圖1，轉(zhuǎn)染效率大于85%。

Figure 1.HepG2 cells transfected by miR-100 mimic(labeled with Cy3 fluorescent dye).圖1 Cy3熒光標(biāo)記的miR-100模擬物轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞

2 肝癌細(xì)胞增殖活力

用CCK-8法分析轉(zhuǎn)染后24 h、48 h和72 h的細(xì)胞增殖活力，測(cè)得實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞450 nm波長(zhǎng)處各孔A值，計(jì)算出細(xì)胞增殖抑制率，見(jiàn)表1。同對(duì)照組細(xì)胞相比，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞在miR-100轉(zhuǎn)染后各時(shí)點(diǎn)的增殖抑制率均顯著升高(P＜0.01)。

表1 HepG2細(xì)胞轉(zhuǎn)染后各檢測(cè)時(shí)點(diǎn)細(xì)胞增殖抑制率Table 1.Inhibitory rate of cell proliferation in transfected HepG2 cells(%.Mean±SD.n=3)

3 細(xì)胞周期分析

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞在轉(zhuǎn)染后72 h G0/G1、S和G2/M期細(xì)胞分布發(fā)生了改變，S期和G2/M期細(xì)胞比例下降，其細(xì)胞增殖指數(shù)(35.8±1.4)較陰性對(duì)照組(39.2 ±1.0)和單純脂質(zhì)體組(40.7 ±2.0)減小 (P ＜0.05)。

4 Plk1表達(dá)情況

通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)和Western blotting相對(duì)灰度值分析，在轉(zhuǎn)染后72 h miR-100實(shí)驗(yàn)組癌細(xì)胞Plk1 mRNA表達(dá)水平較各對(duì)照組降低，見(jiàn)圖2，同樣Plk1蛋白表達(dá)也明顯減少，見(jiàn)圖3。

Figure 2.Plk1 mRNA expression in HepG2 cells 72 h after transfection.HepG2 cells were transfected with miR-100 minic for 72 h.Plk1 mRNA expression was determined by real-time RT-PCR.Mean ±SD.n=3.＊＊P ＜0.01 vs blank control，liposome or negative control.圖2 HepG2細(xì)胞經(jīng)轉(zhuǎn)染后72 h Plk1 mRNA的表達(dá)分析

討 論

肝癌在我國(guó)是最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，每年因肝癌死亡約11萬(wàn)人，占全球肝癌死亡總數(shù)的45%，嚴(yán)重威脅著人民群眾的身體健康。目前在臨床上主要有外科切除、化療、TACE等治療，盡管它們能延長(zhǎng)部分患者的生存時(shí)間，但是都不能取得滿意的結(jié)果。隨著在分子水平上對(duì)肝癌研究的不斷進(jìn)展，基因治療成為臨床應(yīng)用前景最為看好的靶向治療，尋找基于新機(jī)制的治療手段一直是國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)［4-5］。

Figure 3.Plk1 protein expression in HepG2 cells 72 h after transfection.HepG2 cells were transfented with miR-100 minics for 72 h，Plk1 protein was determined by Western blotting assay.A:blank control;B:liposome;C:negative control;D:miR-100.Mean ± SD.n=3.＊＊P ＜0.01 vs A，B or C.圖3 HepG2細(xì)胞經(jīng)轉(zhuǎn)染后72 h Plk1蛋白表達(dá)分析

近年來(lái)研究表明，miRNAs在肝細(xì)胞癌中表達(dá)異常，導(dǎo)致癌基因的激活上調(diào)和抑癌基因的功能缺失，從而調(diào)控癌細(xì)胞增殖和腫瘤生長(zhǎng)［6-7］。Li等［8］分析發(fā)現(xiàn)在HepG2細(xì)胞中miR-224高表達(dá)對(duì)細(xì)胞增殖、分化及轉(zhuǎn)移產(chǎn)生影響，但細(xì)胞周期并無(wú)明顯變化。在本研究中，我們以陽(yáng)離子脂質(zhì)體Oligofectamine為介導(dǎo)，用人工合成的miR-100寡聚核苷酸瞬時(shí)轉(zhuǎn)染人肝癌HepG2細(xì)胞，旨在揭示miR-100對(duì)肝癌細(xì)胞的生物學(xué)作用。經(jīng)CCK-8方法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，miR-100實(shí)驗(yàn)組在轉(zhuǎn)染后24 h、48 h和72 h的細(xì)胞增殖抑制率較其它各對(duì)照組均有顯著上升，說(shuō)明肝癌細(xì)胞的增殖活力受到miR-100的影響而減低。同時(shí)流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果顯示，miR-100實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞周期分布在轉(zhuǎn)染后72h發(fā)生改變，處于S期和G2/M期的細(xì)胞比例下降，細(xì)胞增殖指數(shù)減小，說(shuō)明miR-100的轉(zhuǎn)染引起了肝癌細(xì)胞的細(xì)胞周期變化。由此可見(jiàn)miR-100參與肝癌細(xì)胞的增殖和細(xì)胞周期調(diào)控。

Plk1是一種有絲分裂調(diào)控蛋白，在有絲分裂進(jìn)展中起到十分重要的作用，其高表達(dá)會(huì)促進(jìn)染色體不穩(wěn)定和非整倍體產(chǎn)生?，F(xiàn)已證實(shí)Plk1在許多癌癥中異常表達(dá)，通過(guò)shRNA或化學(xué)抑制劑阻斷Plk1的表達(dá)或降低其激酶活性，無(wú)論是在體外和體內(nèi)都可以有效遏制細(xì)胞增殖和腫瘤生長(zhǎng)，更有意義的是，這種抑制作用可優(yōu)先殺死癌細(xì)胞，而對(duì)于正常細(xì)胞并無(wú)大礙［9-12］，因此Plk1成為一個(gè)理想的腫瘤基因治療新靶點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)針對(duì)Plk1受miR-100調(diào)控，運(yùn)用轉(zhuǎn)染技術(shù)成功建立miRNA干擾模型，經(jīng)qRT-PCR和Western blotting的檢測(cè)分析，結(jié)果表明miR-100寡核苷酸轉(zhuǎn)染抑制了Plk1基因的表達(dá)，勢(shì)必影響細(xì)胞有絲分裂，從而對(duì)癌細(xì)胞的增殖產(chǎn)生阻滯作用，這為進(jìn)一步探索肝癌的靶向治療提供了新的途徑。

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