吳裕丹， 倪嘉延， 陳耀庭， 孫宏亮， 許林鋒△

原發(fā)性肝癌是臨床上最常見惡性腫瘤之一，世界范圍內(nèi)每年約有60萬新發(fā)病例，居惡性腫瘤發(fā)病率的第5位［1-2］。肝癌為血供豐富的實(shí)體惡性腫瘤，由于腫瘤快速生長所需的大量血液供應(yīng)以及養(yǎng)分供給導(dǎo)致肝癌組織細(xì)胞內(nèi)長期處于相對缺氧的微環(huán)境。缺氧誘導(dǎo)因子(hypoxia inducible factors，HIF)家族是缺氧適應(yīng)反應(yīng)的中心環(huán)節(jié)，HIF-1α是HIF最重要的功能性亞基。RNA干擾能特異性地封閉一個或多個基因，而不影響正常等位基因的功能，具有較高的選擇性和特異性，減少非特異作用引起的副作用，是極富有前途的治療手段。本研究通過轉(zhuǎn)染特異性的HIF-1α siRNA于缺氧培養(yǎng)條件下的大鼠CBRH-7919肝癌細(xì)胞，通過檢測HIF-1α、血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)以及增殖相關(guān)因子p21、cyclin D1的表達(dá)變化，探討沉默HIF-1α基因表達(dá)對肝癌細(xì)胞增殖的影響，為臨床抗腫瘤的基因治療提供相關(guān)理論依據(jù)。

材料和方法

1 材料

大鼠CBRH-7919肝癌細(xì)胞株由中山大學(xué)北校區(qū)動物實(shí)驗(yàn)中心提供。RPMI-1640培養(yǎng)基購自Gibico;脂質(zhì)體 LipofectamineTM2000購自 Invitrogen;NC膜購自Pall;HIF-1α、p21及cyclin D1抗體購自Santa Cruz;VEGF抗體購自CST;β-actin抗體購自博士德公司;TRIzol試劑購自TaKaRa;real-time RT-PCR試劑盒購自 TaKaRa;HIF-1α、VEGF及 β-actin引物用Primer 3軟件設(shè)計(jì)，由Invitrogen公司合成。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) CBRH-7919細(xì)胞用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，在二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)(37℃、5%CO2、飽和濕度)連續(xù)培養(yǎng)、傳代。將生長狀態(tài)良好的肝癌細(xì)胞消化下來以(8～10)×104/L密度接種于6孔板于二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)(37℃、5%CO2、飽和濕度)中培養(yǎng)24 h后，加入150 μmol/L CoCl2溶液，用于模擬腫瘤內(nèi)部厭氧環(huán)境。

2.2 厭氧模型的建立 CBRH-7919細(xì)胞在二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)(37℃、5%CO2、飽和濕度)用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中連續(xù)傳代，將生長狀態(tài)良好的肝癌細(xì)胞消化后，以1×105/L密度接種于6孔板培養(yǎng)24 h后，加入不同濃度CoCl2溶液，按CoCl2終濃度分為 5 組:0 μmol/L(常氧組)、100 μmol/L、150 μmol/L、200 μmol/L 和 300 μmol/L，處理時間分別為12和24 h。

2.3 HIF-1α siRNA載體的構(gòu)建 選擇GenBank中大鼠 HIF-1α基因編碼區(qū)序列(coding sequence，CDS)作為分析序列，采用RNAdraw分析軟件對HIF-1α序列的二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測，然后按照Elbashir等推薦的siRNA設(shè)計(jì)原則進(jìn)行設(shè)計(jì)。利用在線設(shè)計(jì)軟件(www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.html)，預(yù)選出3條潛在靶核苷酸序列(靶mRNA):(1)P1:5’-AGUGACUGAUUCUGGCAGCtt-3’，P2:5’-GCUGCCAGAAUCAGUCACUtt-3’;(2)P1:5 ’-GGAUGACUUUAAGCAAGAAtt-3’，P2:5’-UUCUUGCUUAAAGUCAUCCtt-3’;(3)P1:5’-GAAACUCUUCCAAGCAAUUtt-3’，P2:5’-AAUUGCUUGGAAGAGUUUCtt-3’。參照siRNA的基本設(shè)計(jì)原理選擇靶序列，針對目的基因的序列設(shè)計(jì)siRNA表達(dá)載體互補(bǔ)的核苷酸鏈。將siRNA溶液與LipofectamineTM2000試劑混合，形成siRNA/LipofectamineTM2000載體復(fù)合物。

2.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 6孔板種植細(xì)胞(8～10)×104/L，在含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)24 h，細(xì)胞匯合度達(dá)到30% ～50%。將稀釋好的HIF-1α siRNA和 LipofectamineTM2000試劑混合，形成HIF-1α siRNA/LipofectamineTM2000復(fù)合物。將HIF-1α siRNA轉(zhuǎn)染載體加到含有細(xì)胞和培養(yǎng)基的培養(yǎng)板的孔中融合，然后放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。6 h后換含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，20 h恢復(fù)生長后，熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞綠色熒光蛋白的表達(dá)以檢測轉(zhuǎn)染效率。實(shí)驗(yàn)分為空白對照組(僅加入LipofectamineTM2000試劑)和轉(zhuǎn)染組(分別將HIF-1α siRNA 序列1、2、3轉(zhuǎn)染入細(xì)胞)。

2.5 Real-time RT-PCR檢測 mRNA表達(dá)水平

TRIzol法提取6孔板內(nèi)各組細(xì)胞的總RNA并定量;各樣本取2 ng～2 μg總RNA，按TaKaRa公司試劑盒說明進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。應(yīng)用實(shí)時熒光定量RT-PCR檢測，β-actin作為內(nèi)參照。PCR引物:HIF-1α 正義鏈 5'-ACTGCACAGGCCACATTCAT-3'，反義鏈 5'-CGAGGCTGTGTCGACTGAGA-3';β-actin正義鏈5'-CCTAGGCACCAGGGTGTGAT-3'，反義鏈5'-TTGGTGACAATGCCGTGTTC-3'。反應(yīng)體系為 20 μL，反應(yīng)條件為95℃ 3 min預(yù)變性，95℃ 10 s，55℃ 30 s，39個循環(huán)，并在每個循環(huán)延伸末端點(diǎn)收集熒光信號，繪制擴(kuò)增曲線。

2.6 Western blotting檢測 冷PBS洗滌細(xì)胞2次，加入全蛋白裂解液后冰上裂解10 min收獲蛋白。將抽提蛋白用BCA法定量后，于100 V泳道進(jìn)行SDSPAGE;電泳結(jié)束后，以30 mA、120 min將蛋白轉(zhuǎn)移至NC膜;封閉液(5%BSA/TBST)封閉60 min，加入Ⅰ抗(1∶3 000)4℃過夜，Ⅱ抗(1∶6 000)室溫下雜交120 min，TBST洗膜3次后用ECL試劑盒進(jìn)行發(fā)光反應(yīng)，壓片、顯影、定影，觀察蛋白印跡并進(jìn)行圖像分析。

2.7 MTT檢測肝癌細(xì)胞增殖 選擇對數(shù)生長期細(xì)胞，用不含EDTA的胰蛋白酶收集處理后的細(xì)胞，800×g離心10 min，沉淀采用300 μL PBS重懸，逐滴加入700 μL預(yù)冷的無水乙醇中，乙醇終濃度為70%，4℃避光固定過夜。800×g離心10 min，去上清。PBS洗2次。重懸細(xì)胞于500 μL含1×105U/L的RNase A的PBS緩沖液中，避光，37℃孵育30 min。加2 g/L PI至終濃度50 mg/L，避光孵育30 min。流式細(xì)胞儀激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長525 nm檢測。

2.8 BrdU摻入實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖 細(xì)胞在轉(zhuǎn)染后24 h，取對數(shù)生長的細(xì)胞，用0.25%胰酶消化細(xì)胞，以完全培養(yǎng)基(含10%FBS的RPMI-1640)重懸細(xì)胞沉淀，將細(xì)胞種于無菌蓋玻片上，孵箱培養(yǎng)細(xì)胞，待其貼壁。用無血清培養(yǎng)基饑餓細(xì)胞48 h后，更換含血清培養(yǎng)基，孵育4 h。取出蓋玻片，用10 μmol/L BRDU標(biāo)記細(xì)胞1 h。倒去培養(yǎng)基，PBS洗干凈。吸去固定液，PBS洗2～3次各5 min。滴加用0.1%檸檬酸三鈉緩沖液配制成的0.1%的曲拉通溶液，室溫下破膜5～10 min，以增加細(xì)胞的通透性。倒掉曲拉通溶液，PBS洗2～3次各5 min，滴加3%過氧化氫溶液阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，室溫10 min。倒掉過氧化氫溶液，PBS洗2～3次各5 min，滴加正常山羊血清封閉液阻斷內(nèi)源性生物素，室溫下10～30 min。甩去血清，每張切片加1滴或50 μL的Ⅰ抗，37℃孵育60 min或4℃過夜。PBS洗2～3次各5 min，甩去PBS液，每張切片加50 μLⅡ抗，室溫下孵育30～60 min。PBS洗細(xì)胞5 min×3次，Olympus BX51熒光顯微鏡拍照。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 17.0版軟件分析。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差 (mean±SD)表示，兩組間采用t檢驗(yàn)，多個不同處理組組內(nèi)、組間計(jì)量資料的比較應(yīng)用單因素方差分析。取雙側(cè)為檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 不同濃度CoCl2條件下肝癌細(xì)胞的活性

實(shí)驗(yàn)組隨著CoCl2濃度的逐漸增高，CBRH-7919細(xì)胞活性趨于減小，其中CoCl2濃度為800 μmol/L時，細(xì)胞的活性最小;CoCl2濃度為100～200 μmol/L時，細(xì)胞的活性相對較高，見圖1。

2 不同濃度CoCl2對HIF-1α和VEGF表達(dá)的影響

隨著 CoCl2濃度升高，HIF-1α和 VEGF mRNA相對表達(dá)量逐漸增高，濃度為200 μmol/L時達(dá)到峰值，各組與常氧處理組相比，均有顯著差異(P＜0.05)。300 μmol/L 組，HIF-1α 和 VEGF mRNA 表達(dá)呈現(xiàn)下降趨勢。相同濃度組隨著處理的時間延長至24 h，細(xì)胞的HIF-1α mRNA相對表達(dá)量進(jìn)一步增加，表達(dá)仍以200 μmol/L濃度組為最高值，隨后表達(dá)反而開始降低，見圖2。與此同時，細(xì)胞的HIF-1α和VEGF蛋白表達(dá)水平也呈現(xiàn)類似的表達(dá)規(guī)律(P＜0.05)，見圖 3。

Figure 1.Effects of CoCl2on the viability of CBRH-7919 cells detected by MTT assay.Mean ± SD.n=3.圖1 MTT檢測缺氧條件下CBRH-7919細(xì)胞的活性

Figure 2.Effects of CoCl2on the mRNA expression of HIF-1α(A)and VEGF(B)in CBRH-7919 cells.Mean ±SD.n=3.*P ＜0.05 vs 0 μmol/L.圖2 不同濃度CoCl2對CBRH-7919細(xì)胞HIF-1α和VEGFmRNA表達(dá)的影響

Figure 3.The protein expression of HIF-1α (A)and VEGF(B)under different concentrations(0 ～300 μmol/L)of CoCl2.Mean ±SD.n=3.*P ＜0.05 vs 0 μmol/L.圖3 不同濃度CoCl2(0～300 μmol/L)處理后HIF-1α和VEGF蛋白表達(dá)的變化

3 HIF-1α siRNA對HIF-1α和VEGF表達(dá)的影響

未轉(zhuǎn)染HIF-1α siRNA表達(dá)載體的對照組HIF-1α和VEGF mRNA表達(dá)沒有顯著變化，轉(zhuǎn)染3組不同的 HIF-1α siRNA表達(dá)載體后，HIF-1α和 VEGF mRNA表達(dá)明顯減少(P＜0.05)，見圖4。同步檢測結(jié)果顯示，各轉(zhuǎn)染組HIF-1α和VEGF的蛋白表達(dá)亦受到明顯抑制(P＜0.05)，轉(zhuǎn)染組與對照組HIF-1α和VEGF蛋白表達(dá)相比較明顯減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見圖5。

Figure 4.Changes of mRNA expression of HIF-1α and VEGF 24 h after siRNA transfection.Mean ± SD.n=3.*P ＜0.05 vs control.圖4 不同siRNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞24 h后 HIF-1α和VEGF mRNA表達(dá)的變化

Figure 5.The protein expression of HIF-1α and VEGF 24 h after siRNA transfection.Mean±SD.n=3.*P ＜0.05 vs control.圖5 不同的siRNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞24 h后 HIF-1α和VEGF蛋白表達(dá)的變化

4 HIF-1α siRNA 對 HIF-1α、VEGF、p21 及 cyclin D1表達(dá)的影響

HIF-1α siRNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)染組 HIF-1α、VEGF及cyclin D1蛋白表達(dá)較對照組顯著減少，p21蛋白表達(dá)較對照組明顯增多，轉(zhuǎn)染組與對照組的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見圖6。

5 HIF-1α siRNA對肝癌細(xì)胞增殖的影響

HIF-1α siRNA轉(zhuǎn)染組的BrdU陽性細(xì)胞比例與對照組相比明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見圖7。

討 論

HIF-1是由Semenza等［3］于1992年在缺氧誘導(dǎo)的細(xì)胞核抽提物中發(fā)現(xiàn)的一種重要的核轉(zhuǎn)錄因子。HIF-1由HIF-1α和HIF-1β 2個亞基組成，HIF-1α決定HIF-1的活性。HIF-1α在惡性腫瘤信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中扮演重要的角色，是腫瘤細(xì)胞對缺氧適應(yīng)反應(yīng)的中心環(huán)節(jié)，與腫瘤細(xì)胞增殖、腫瘤血管新生密切相關(guān)［4-5］。

近期的研究［6］顯示HIF-1α可能在VEGF表達(dá)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中起著關(guān)鍵的作用，體現(xiàn)于HIF-1α可在多個層次調(diào)節(jié)VEGF的表達(dá)，其主要作用包括增強(qiáng)VEGF的轉(zhuǎn)錄活性與增加VEGF mRNA穩(wěn)定性2個方面。VEGF是最早被發(fā)現(xiàn)的可被缺氧環(huán)境誘導(dǎo)生成并促進(jìn)腫瘤新生血管生成的生長因子［7］。HIF-1α上調(diào)的VEGF表達(dá)增多不僅能夠刺激腫瘤新生血管的形成，維持腫瘤的生長，而且發(fā)現(xiàn)腫瘤患者體內(nèi)高水平的VEGF表達(dá)，與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［8-9］。在本研究中，通過轉(zhuǎn)染特異性siRNA沉默HIF-1α，同步檢測發(fā)現(xiàn)VEGF的表達(dá)亦明顯受到抑制，與上述相關(guān)結(jié)論相一致。這些結(jié)果提示，通過沉默HIF-1α基因表達(dá)，下調(diào)VEGF的表達(dá)，可對腫瘤

Figure 6.The protein expression of HIF-1α，VEGF，p21 and cyclin D1 24 h after siRNA transfection.Mean ±SD.n=3.*P ＜0.05 vs control.圖6 siRNA 轉(zhuǎn)染24 h后 HIF-1α、VEGF、p21及 cyclin D1蛋白表達(dá)的變化

Figure 7.The proliferation of hepatoma cells detected by BrdU incorporation assay.Mean ± SD.n=3.*P ＜0.05 vs control.圖7 BrdU摻入實(shí)驗(yàn)檢測肝癌細(xì)胞的增殖變化

新生血管的生成，以及對腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移的控制起到 關(guān)鍵的作用。

p21蛋白和cyclin D1蛋白是細(xì)胞周期調(diào)控的關(guān)鍵蛋白。p21基因是一種廣譜的CDK抑制基因，位于人染色體6p21.2，是細(xì)胞周期進(jìn)展的負(fù)性調(diào)節(jié)因子。p21基因參與誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其蛋白產(chǎn)物表達(dá)的增多與細(xì)胞凋亡的增多有關(guān)。p21蛋白不僅可抑制CDK的活性，而且還可通過抑制DNA聚合酶間接阻止DNA合成［10-12］。體外實(shí)驗(yàn)及體內(nèi)研究均已證實(shí)p21蛋白的表達(dá)能抑制腫瘤細(xì)胞的生長。Cyclin D1參與G1/S期轉(zhuǎn)換的調(diào)控，是細(xì)胞周期重要的正性調(diào)控因子［13-14］。本研究中，特異性siRNA轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞后，HIF-1α表達(dá)明顯減少，細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白cyclin D1的表達(dá)亦明顯受到抑制，p21蛋白的表達(dá)卻明顯增多。

為進(jìn)一步證明siRNA沉默HIF-1α基因表達(dá)對肝癌細(xì)胞增殖的抑制作用，本研究通過BrdU嵌入試驗(yàn)檢測肝癌細(xì)胞增殖情況。我們發(fā)現(xiàn)，HIF-1α siRNA轉(zhuǎn)染組的BrdU陽性細(xì)胞比例明顯小于未轉(zhuǎn)染siRNA的對照組，說明轉(zhuǎn)染組肝癌細(xì)胞的DNA合成量明顯少于對照組肝癌細(xì)胞。這提示，siRNA轉(zhuǎn)染組肝癌細(xì)胞的增殖活性受到明顯抑制。因此，我們認(rèn)為基因表達(dá)沉默HIF-1α可明顯抑制肝癌細(xì)胞的增殖作用。

綜上所述，利用特異性siRNA沉默HIF-1α，一方面通過下調(diào)VEGF的表達(dá)可抑制腫瘤血管生成，控制腫瘤生長、侵襲及轉(zhuǎn)移;另一方面，通過對p21蛋白和cyclin D1蛋白表達(dá)的影響，抑制腫瘤細(xì)胞增殖、控制腫瘤進(jìn)展，為臨床上惡性腫瘤的基因治療提供有效基因靶點(diǎn)及可靠的理論依據(jù)。

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