劉 寧， 孫連坤， 楊曉春， 馬麗偉， 蘇 靜

多藥耐藥是臨床腫瘤治療面臨的嚴(yán)重問題。研究表明可溶性耐藥相關(guān)鈣結(jié)合蛋白(soluble resistance-related calcium-binding protein，sorcin)在白血病、胃癌、卵巢癌等多種腫瘤耐藥細(xì)胞中高表達(dá)，且表達(dá)量與耐藥性呈一定的相關(guān)性［1-2］。有證據(jù)顯示，在多種耐藥細(xì)胞中，出現(xiàn)了編碼P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)的基因和編碼sorcin的基因共擴增的現(xiàn)象，還出現(xiàn)多藥耐藥相關(guān)蛋白1(multidrug resistance-associated protein 1，MRP1)的高表達(dá)。多藥耐藥基因1編碼的P-gp是一種ATP依賴的外排泵，可將多種物質(zhì)包括化療藥物排出細(xì)胞外，降低細(xì)胞內(nèi)的藥物濃度，P-gp在多藥耐藥細(xì)胞中的重要作用已經(jīng)被證實［3-4］。盡管有研究報道sorcin的過度表達(dá)伴隨著P-gp的過度表達(dá)［5-6］，但sorcin在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)以及與膠質(zhì)瘤P-gp的關(guān)系目前尚未有報道。本實驗通過RNA干擾的方法沉默膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞中sorcin的表達(dá)，觀察抑制sorcin表達(dá)對U251細(xì)胞順鉑敏感性的影響，并進一步探討sorcin參與膠質(zhì)瘤細(xì)胞耐藥的機制。

材料和方法

1 主要試劑

十二烷基硫酸鈉、丙烯酰胺和甘氨酸購自長春寶信生物技術(shù)責(zé)任有限公司;氨芐青霉素、瓊脂糖、瓊脂粉、胰蛋白胨及酵母提取物購自O(shè)xoid;全部引物合成與測序、質(zhì)粒提取試劑盒、T4 DNA連接酶、BamHⅠ、HindⅢ限制性內(nèi)切酶、DNA凝膠回收試劑盒、MMV逆轉(zhuǎn)錄酶和DNA marker購自大連寶生物(TaKaRa)工程公司;脂質(zhì)體Lipofectamine 2000、Trizol和新生牛血清購自Invitrogen;IMDM培養(yǎng)基購自HyClone;sorcin、P-gp和MRP1抗體購自Santa Cruz;β-actin抗體購自Epitomics;Ⅱ抗購自Pierce。

2 細(xì)胞

人神經(jīng)膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞系由吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室保存。U251細(xì)胞培養(yǎng)在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，用含10%新生牛血清的IMDM培養(yǎng)基常規(guī)方法培養(yǎng)，0.25%胰酶消化傳代，取處于對數(shù)生長期細(xì)胞分組進行實驗。

3 主要方法

3.1 sorcin特異性siRNA表達(dá)載體pSilencerTM3.1-H1-sorcin siRNA的構(gòu)建 siRNA表達(dá)載體選用pSilencerTM3.1-H1(Amion)。根據(jù)GenBank人源sorcin mRNA已知序列，針對編碼區(qū)選擇位點設(shè)計1段堿基序列TGCTGGATAGAGATATGTC，按質(zhì)粒說明書在www.ambion.com在線設(shè)計siRNA模板序列:正義鏈5'-GAT CCG TGC TGG ATA GAG ATA TGT CTT CAA GAG AGA CAT ATC TCT ATC CAG CAT TTT TTG GAA A-3'，反義鏈為 5'-AGC TTT TCC AAA AAA TGC TGG ATA GAG ATA TGT CTC TCT TGA AGA CAT ATC TCT ATC CAG CAC G-3'。sorcin siRNA模板寡核苷酸退火:各取2 μL模板，加入46 μL 1× DNA退火溶液，總體積為50 μL，90℃ 3 min，降溫至37℃，孵育1 h;將退火的sorcin siRNA模板寡核苷酸連接到線性化的pSilencerTM3.1-H1 siRNA表達(dá)載體:取退火的sorcin siRNA模板寡核苷酸5 μL，加45 μL去核酸酶水稀釋，T4 DNA連接酶1 μL，10×T4 DNA連接 buffer 1 μL，載體 1 μL，加去核酸酶水 6 μL 至總體積為10 μL，4℃孵育過夜。

3.2 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化JM109大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞取100 μL大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞，加入連接反應(yīng)產(chǎn)物5 μL混勻，冰浴30 min。42℃水浴90 s，迅速冰浴2 min。加入LB液體培養(yǎng)基800 μL，37℃溫和振蕩培養(yǎng)1 h。取200 μL菌液接種到含氨芐青霉素(50 mg/L)的LB平板，倒置平皿37℃培養(yǎng)16～20 h，觀察菌落生長情況。

3.3 陽性重組克隆的篩選、擴增及質(zhì)粒提取 挑取LB平板的單菌落加到含氨芐青霉素(100 mg/L)的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)12～16 h，按質(zhì)粒試劑盒說明書提取質(zhì)粒。

3.4 重組質(zhì)粒的鑒定和測序 用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和 HindⅢ對 pSilencerTM3.1-H1-sorcin siRNA重組質(zhì)粒(Si-sorcin)進行雙酶切(質(zhì)粒8 μL;BamH I 1 μL;HindⅢ 1 μL;10 × H buffer 2 μL;ddH2O 8 μL;總體積20 μL，混勻，37 ℃ 水浴2 h)，取5 μL 酶切產(chǎn)物進行2%瓊脂糖凝膠電泳，釋放出目的片段的質(zhì)粒為陽性重組質(zhì)粒。陽性質(zhì)粒經(jīng)上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司自動測序儀測序。

3.5 Si-sorcin轉(zhuǎn)染U251細(xì)胞 轉(zhuǎn)染細(xì)胞分為Siscramble組(空載體對照組)和Si-sorcin組，將對數(shù)生長期U251細(xì)胞接種于100 mm平皿中，待細(xì)胞生長融合率達(dá)到80～90%，按Lipofectamine 2000說明書將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到U251細(xì)胞中:取16 μg質(zhì)粒溶于IMDM培養(yǎng)液(不含血清)，終體積為800 μL;將40 μL Lipofectamine 2000溶于800 μL IMDM 培養(yǎng)液(不含血清)中;將上述2種液體混勻，室溫孵育20 min，以形成DNA-Lipofectamine 2000復(fù)合物。U251細(xì)胞用IMDM培養(yǎng)液(不含血清)洗3次，加入DNA-Lipofectamine 2000復(fù)合物，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng);4 h后用含10%血清IMDM培養(yǎng)液洗3次，加10 mL含10%血清IMDM培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

3.6 RT-PCR檢測 U251細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染Si-scramble和Si-sorcin質(zhì)粒后，離心收集細(xì)胞，Trizol法提取總RNA，每組按照AMV逆轉(zhuǎn)錄酶(TaKaRa)說明書進行第1鏈cDNA合成，將合成的cDNA進行PCR擴增反應(yīng)。2 × Taq Master 12.5 μL，cDNA 2 μL，引物各10 μL，用 ddH2O將反應(yīng)體系補至25 μL。取10 μL擴增產(chǎn)物，2%瓊脂糖凝膠進行DNA電泳，采用天能凝膠成像系統(tǒng)拍照。引物序列如表1所示，擴增條件為:94℃ 2 min;94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃30 s，27～30個循環(huán)，72 ℃ 10 min。

表1 引物序列Table 1.Sequences of the primers

3.7 Western bloting檢測 U251細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染Siscramble和Si-sorcin質(zhì)粒后，離心收集細(xì)胞，冷PBS洗滌2次，加入細(xì)胞裂解液并提取蛋白，測濃度后取60 μg蛋白進行SDS-PAGE電泳，采用Bio-Rad轉(zhuǎn)移裝置將蛋白移至PVDF膜，轉(zhuǎn)膜結(jié)束后將PVDF膜放入5% 的脫脂奶粉中1～2 h，封閉膜上的非特異結(jié)合位點，分別加入Ⅰ抗(β-actin、sorcin、P-gp 和MRP1)，4℃冰箱中過夜。次日PBST洗膜3次，分別為15 min、5 min 和 5 min，再分別加入 1∶1 000 稀釋的鼠、兔和山羊Ⅱ抗室溫孵育1.5 h，倒掉Ⅱ抗，PBST洗膜3次，DAB顯色，凝膠成像系統(tǒng)采集圖像后保存。

3.8 MTT法檢測細(xì)胞生存率 U251細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染Si-scramble和 Si-sorcin 質(zhì)粒后，加入 0、1.25、2.5、5、10和20 mg/L順鉑，每個濃度設(shè)5個復(fù)孔，作用24 h，每孔加入20 μL MTT，孵育4 ～6 h，棄掉培養(yǎng)液，每孔加入150 μL DMSO，振蕩器振蕩10 min充分溶解甲臜顆粒，酶標(biāo)儀上選取490 nm波長，測定各孔的吸光度，記錄結(jié)果。

4 統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，采用SPSS 11.5軟件分析，組間均值比較采用ANOVA檢驗。電泳條帶密度值以灰度×面積/參照物的比值表示。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 Si-sorcin表達(dá)載體的酶切及測序鑒定

質(zhì)粒試劑盒提取質(zhì)粒后，用BamHⅠ和HindⅢ雙酶切連接有目的片段的Si-sorcin表達(dá)質(zhì)粒，2%瓊脂糖凝膠電泳，獲得66 bp的目的片段，見圖1。對該片段進行DNA測序，結(jié)果證實sorcin siRNA片段與pSilencerTM3.1-H1 siRNA共表達(dá)載體連接反應(yīng)正確。

2 轉(zhuǎn)染Si-sorcin表達(dá)載體對U251細(xì)胞sorcin mRNA表達(dá)的影響

U251細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染Si-scramble和Si-sorcin，RTPCR結(jié)果如圖2所示，與未轉(zhuǎn)染的對照細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染Si-scramble U251細(xì)胞其sorcin mRNA表達(dá)無明顯變化(P＞0.05)，轉(zhuǎn)染Si-sorcin的U251細(xì)胞其sorcin mRNA表達(dá)明顯降低(P＜0.05)。

Figure 1.Identification of Si-sorcin expression plasmid by restriction enzyme digestion.M:DL2000 DNA marker;Lane 1:Si-sorcin plasmid;Lane 2:Si-sorcin plasmid digested by BamHⅠ and HindⅢ.圖1 Si-sorcin表達(dá)質(zhì)粒的酶切鑒定

Figure 2.RT-PCR analysis of sorcin mRNA expression in U251 cells transfected with siRNA.Lane 1:control;Lane 2:Si-scramble plasmid;Lane 3:Si-sorcin plasmid.Mean±SD.n=3.*P ＜0.05 vs control.圖2 轉(zhuǎn)染Si-sorcin表達(dá)質(zhì)粒后U251細(xì)胞sorcin mRNA表達(dá)的變化

3 轉(zhuǎn)染Si-sorcin表達(dá)載體對U251細(xì)胞的sorcin蛋白表達(dá)的影響

U251細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染 Si-scramble和 Si-sorcin，Western blotting結(jié)果如圖3所示，與未轉(zhuǎn)染的對照細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染Si-scramble的U251細(xì)胞sorcin蛋白表達(dá)無明顯變化(P＞0.05)，轉(zhuǎn)染Si-sorcin的 U251細(xì)胞sorcin蛋白表達(dá)明顯降低(P＜0.05)。

4 抑制sorcin表達(dá)后U251細(xì)胞對順鉑敏感性的變化

U251細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染Si-scramble和Si-sorcin后，用不同濃度順鉑作用24 h，檢測各組細(xì)胞的生存率。在不同濃度順鉑作用下，與control組相比，Si-scramble組的細(xì)胞生存率無明顯變化(P＞0.05)，而Sisorcin組的細(xì)胞生存率明顯降低(P＜0.05)，見圖4。Control組、Si-scramble組和Si-sorcin組的順鉑IC50分別為12.0 mg/L、11.8 mg/L 和 6.5 mg/L，提示抑制sorcin的表達(dá)能明顯降低U251細(xì)胞的生存率，增加U251細(xì)胞對順鉑的敏感性。

Figure 3.Western blotting analysis of sorcin protein expression in U251 cells transfected with siRNA.Lane 1:control;Lane 2:Si-scramble plasmid;Lane 3:Si-sorcin plasmid.Mean±SD.n=3.*P ＜0.05 vs control.圖3 轉(zhuǎn)染Si-sorcin表達(dá)質(zhì)粒后U251細(xì)胞sorcin蛋白表達(dá)的變化

Figure 4.The viability of U251 cells transfected with siRNA under the condition of cisplatin exposure.Mean ± SD.n=3.*P ＜0.05 vs control.圖4 轉(zhuǎn)染Si-sorcin表達(dá)質(zhì)粒后U251細(xì)胞在不同濃度順鉑處理下的存活率

5 抑制sorcin表達(dá)對P-gp和MRP1蛋白表達(dá)的影響

U251細(xì)胞轉(zhuǎn)染Si-scramble和Si-sorcin后，Western blotting結(jié)果顯示，與 control組相比，轉(zhuǎn)染 Siscramble的U251細(xì)胞MRP1和P-gp蛋白的表達(dá)無明顯變化(P＞0.05)，而轉(zhuǎn)染Si-sorcin的U251細(xì)胞MRP1和P-gp蛋白的表達(dá)明顯降低(P＜0.05)，見圖5。

Figure 5.The protein expression of P-gp and MRP1 in U251 cells transfected with siRNA.Lane 1:control;Lane 2:Si-scramble plasmid;Lane 3:Si-sorcin plasmid.Mean ± SD.n=3.*P ＜0.05 vs control.圖5 轉(zhuǎn)染Si-sorcin表達(dá)質(zhì)粒后U251細(xì)胞P-gp和MRP1蛋白表達(dá)的變化

討 論

腫瘤耐藥的形成是多基因、多種分子機制共同作用的結(jié)果［7］。耐藥基因及其相關(guān)蛋白包括:多藥耐藥基因1及其產(chǎn)物P-gp、MRP1、乳腺癌耐藥相關(guān)蛋白 (breast cancer resistance protein，BCRP)和肺耐藥相關(guān)蛋白(lung resistance-related protein，LRP)等，這些耐藥基因的異常表達(dá)與腫瘤耐藥之間存在廣泛聯(lián)系［8-11］。Sorcin是1986年首次在長春新堿誘導(dǎo)的中國倉鼠多藥耐藥細(xì)胞株中發(fā)現(xiàn)的一種胞漿蛋白，分子量為22 kD，其表達(dá)和功能與腫瘤耐藥相關(guān)［12］。

本實驗設(shè)計sorcin RNA干擾靶位點并連接到表達(dá)載體，經(jīng)雙酶切和測序鑒定表明，sorcin siRNA表達(dá)載體構(gòu)建成功。通過RT-PCR和Western blotting檢測，可見轉(zhuǎn)染Si-sorcin明顯抑制U251細(xì)胞的sorcin mRNA和蛋白的表達(dá)。MTT結(jié)果顯示，抑制sorcin基因表達(dá)可以增加U251細(xì)胞對順鉑的敏感性，提示sorcin基因可能參與了膠質(zhì)瘤對順鉑的耐藥過程。

近來研究表明，sorcin是一個磷酸化的鈣結(jié)合蛋白，可以改變細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度，從而影響鈣相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，使受鈣調(diào)節(jié)的蛋白活性與功能發(fā)生改變［2，13］。由多藥耐藥基因1編碼的 P-gp是一種膜糖蛋白，具有ATP結(jié)合位點，依賴ATP可以將多種化療藥物排出細(xì)胞外，從而降低細(xì)胞內(nèi)的藥物濃度，導(dǎo)致多藥耐藥［14］。磷酸化的P-gp是有活性的，sorcin作為一種鈣結(jié)合蛋白，可能通過參與調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鈣水平來調(diào)控P-gp的磷酸化狀態(tài)，從而影響P-gp的功能［15］。本實驗結(jié)果顯示，抑制sorcin基因可以降低細(xì)胞中P-gp和MRP1蛋白的表達(dá)，因此推測sorcin可能是P-gp工作單位的一部分，在與P-gp相互作用的過程中介導(dǎo)耐藥。

綜上所述，調(diào)節(jié)sorcin基因的表達(dá)是影響膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞對順鉑耐藥的一個重要因素，特異性抑制sorcin基因表達(dá)可抑制耐藥基因的效應(yīng)，增加U251細(xì)胞對順鉑的敏感性?；趕orcin這一靶點設(shè)計合成新的耐藥逆轉(zhuǎn)劑，有可能成為逆轉(zhuǎn)膠質(zhì)瘤多藥耐藥的新策略。

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