朱慧麗， 翁澤平， 張繼君， 林琛蒞， 謝思明， 王 超， 馬繼偉， 鐘雪云△

腦膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，約占所有原發(fā)顱內(nèi)腫瘤的40%［1］。由于腦膠質(zhì)瘤復(fù)發(fā)率高，復(fù)發(fā)后大多惡性度增加，且產(chǎn)生耐藥性。一旦復(fù)發(fā)，再次接受手術(shù)的致殘、致死率極高，因此化、放療是復(fù)發(fā)后治療的主要手段［2］。耐藥性的產(chǎn)生是腦膠質(zhì)瘤治療的最重要障礙之一。目前對耐藥的研究主要集中在膜轉(zhuǎn)運蛋白和DNA修復(fù)蛋白上，但針對其位點的藥物開發(fā)尚未取得明顯進(jìn)展［3］。前期研究中本實驗室從人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系SWO-38中克隆出SWOZ1和SWOZ2兩株亞系［4-5］，同時我們利用敏感細(xì)胞株SWOZ2誘導(dǎo)出對卡氮芥［carmustine，1，3-bis(2-chloroethyl)-1-nitrosourea，BCNU］耐藥的細(xì)胞系SWOZ2-BCNU［6］。SWOZ2-BCNU 細(xì)胞對BCNU 耐藥性較SWOZ2細(xì)胞高出約5倍，為我們研究人腦膠質(zhì)瘤獲得性耐藥提供了理想的細(xì)胞模型［7］。

真核翻譯起始因子4E結(jié)合蛋白1(eukaryotic translation initiation factor 4E-binding protein 1，4EBP1)由118個氨基酸組成，編碼基因定位于染色體8p12，對真核翻譯起始因子4E(eukaryotic translation initiation factor 4E，eIF4E)活性的調(diào)節(jié)發(fā)揮重要的作用。4E-BP1主要參與蛋白質(zhì)合成、細(xì)胞生長、增殖和代謝，近年研究發(fā)現(xiàn)其與多種腫瘤的惡性度和預(yù)后密切相關(guān)［8-10］。2009 年 Tam 等［11］報道了4E-BP1參與調(diào)節(jié)肝癌細(xì)胞對化療藥物的敏感性，最近又有學(xué)者相繼報道了磷酸化4E-BP1作為腫瘤細(xì)胞對化療藥敏感的標(biāo)志物［12-13］，但暫無4E-BP1與膠質(zhì)瘤耐藥的報道。前期研究中我們發(fā)現(xiàn)人腦膠質(zhì)瘤SWOZ2細(xì)胞中4E-BP1表達(dá)較其獲得性耐藥細(xì)胞株SWOZ2-BCNU明顯增加。本文通過RNA干擾實驗探討4EBP1及其磷酸化水平對人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞BCNU耐藥性的影響，為尋找克服膠質(zhì)瘤獲得性耐藥的新靶點提供理論依據(jù)。

材料和方法

1 主要材料和儀器

人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞SWO-38由暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室自建，SWOZ2細(xì)胞從SWO-38細(xì)胞系中通過單克隆形式分離獲得，耐藥細(xì)胞株SWOZ2-BCNU由SWOZ細(xì)胞通過BCNU大劑量誘導(dǎo)獲得。改良型RPMI-1640購自HyClone，細(xì)胞計數(shù)試劑盒-8(cell counting kit-8，CCK-8)購自 WST，4E-BP1、p-4E-BP1(T37/46)、p-4E-BP1(T70)、p-4E-BP1(S65)和α-tubulin抗體均購自CST，核漿分離試劑盒購自BioVision，加強型化學(xué)發(fā)光液(ECL)購自Pierce，4EBP1 siRNA由銳博公司設(shè)計合成，Lipofectamine 2000脂質(zhì)體購于Invitrogen，垂直電泳槽及半干式電轉(zhuǎn)移儀器均購自Bio-Rad。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人腦膠質(zhì)瘤SWOZ2和SWOZ2-BCNU細(xì)胞培養(yǎng)于RPMI-1640培養(yǎng)基，其中含10%胎牛血清。將培養(yǎng)瓶置于37℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.2 蛋白提取及Western blotting檢測 收集細(xì)胞，按照1×1012cells/L加入預(yù)冷的RIPA buffer和苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF)混合液。取蛋白樣本10～20 μg，經(jīng)5%和10% 十二烷基硫酸鈉－聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)2 h(濃縮膠60 V，分離膠100 V)，電轉(zhuǎn)儀350 mA恒流1 h轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜，經(jīng)5%BSA室溫封閉1 h，Ⅰ抗 4E-BP1、p-4E-BP1(T37/46)、p-4E-BP1(T70)、p-4E-BP1(S65)和 α-tubulin(1∶1 000 稀釋)4℃孵育過夜，TBS-T洗膜3次，Ⅱ抗稀釋液(稀釋比例1∶3 000)室溫孵育2 h，ECL底物化學(xué)發(fā)光試劑盒顯影，X膠片曝光、顯影、定影，BI2000灰度掃描分析條帶。

2.3 siRNA-脂質(zhì)體混合物的制備及轉(zhuǎn)染 制備過程嚴(yán)格遵守脂質(zhì)Lipofectamine 2000脂質(zhì)體說明書要求，優(yōu)化siRNA和脂質(zhì)體的用量提高轉(zhuǎn)染效率。最終選用的siRNA濃度為50 nmol/L，稀釋siRNA和Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑所選用的培養(yǎng)基均不含血清和抗生素，轉(zhuǎn)染約6 h后更換含有血清不含抗生素的培養(yǎng)基，根據(jù)實驗要求進(jìn)行后續(xù)實驗。

2.4 耐藥性檢測 將呈對數(shù)生長的 SWOZ2和SWOZ2-BCNU細(xì)胞以每孔1 000個接種于96孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24 h后換入藥物濃度呈2倍遞增的BCNU(2～128 mg/L)，另設(shè)不加藥物的對照孔以及不加藥物和細(xì)胞的空白對照，每種藥物濃度做4個平行孔。培養(yǎng)72 h后，更換培養(yǎng)基，加入100 μL不含藥物的新鮮培養(yǎng)基和10 μL CCK-8試劑，繼續(xù)培養(yǎng)2 h后在酶標(biāo)儀上檢測波長為450 nm的吸光度(absorbance，A)，用 SPSS 13.0 軟件中的 Probit法計算出藥物的半數(shù)抑制濃度(50%inhibitory concentration，IC50)。

2.5 細(xì)胞免疫熒光檢測 SWOZ2和SWOZ2-BCNU細(xì)胞接種于已放入蓋玻片的6孔培養(yǎng)板，24 h貼壁后4%多聚甲醛固定30 min，0.2%Triton X-100室溫10～15 min，10%BSA 封閉60 min，加4E-BP1和 p-4E-BP1(T70)Ⅰ抗(1∶200稀釋)4℃靜置過夜，避光下滴加熒光標(biāo)記的Ⅱ抗，室溫孵育1 h，每孔分別加入適量的DAPI溶液，將蓋玻片蓋于載玻片上，緩沖甘油封片，避光條件下，用激光共聚焦顯微鏡觀察并拍照。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，組間均數(shù)比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 4E-BP1及其磷酸化蛋白在SWOZ2和SWOZ2-BCNU細(xì)胞中的表達(dá)

獲得性耐藥細(xì)胞株SWOZ2-BCNU中4E-BP1及其磷酸化蛋白 p-4E-BP1(T37/46)、p-4E-BP1(T70)和p-4E-BP1(S65)表達(dá)較SWOZ2細(xì)胞明顯下降(P＜0.05)，但2株細(xì)胞中p-4E-BP1(T70)占總蛋白比例的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，見圖1。這說明4E-BP1通過表達(dá)量的改變參與人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的獲得性耐藥。

2 4E-BP1沉默后SWOZ2細(xì)胞對BCNU耐藥性的變化

Figure 1.Expression of 4E-BP1 and its phosphorylated proteins in SWOZ2 and SWOZ2-BCNU cells.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs SWOZ2 group.圖14E-BP1及其磷酸化蛋白在SWOZ2和SWOZ2-BCNU細(xì)胞中的表達(dá)水平

小分子RNA干擾4E-BP1基因的有效濃度為50 nmol/L，48 h后Western blotting檢測顯示4E-BP1及其磷酸化蛋白表達(dá)明顯下降 (P＜0.05)，見圖2A。下調(diào)4E-BP1表達(dá)后SWOZ2細(xì)胞對BCNU的敏感性明顯下降 (P＜0.05)，IC50值明顯增高 (P＜0.05)，出現(xiàn)了藥物抵抗，見圖2B、C。

Figure 2.Down-regulation of 4E-BP1 reduced the sensitivity of SWOZ2 cells to BCNU.A:expression of 4E-BP1 and its phosphorylated proteins in SWOZ2 cells with or without 4E-BP1 siRNA transfection was detected by Western blotting;B:viability of SWOZ2 cells with or without 4E-BP1 siRNA transfection treated with different concentrations of BCNU was measured by CCK-8 assay;C:IC50of BCNU for SWOZ2 cells with or without 4E-BP1 siRNA transfection.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs control group.圖2 小干擾RNA下調(diào)4E-BP1表達(dá)后SWOZ2細(xì)胞對BCNU耐藥性的改變

3 4E-BP1及其磷酸化蛋白 p-4E-BP1(T70)在SWOZ2和SWOZ2-BCNU細(xì)胞中表達(dá)位置的差異

激光共聚焦顯微鏡檢測4E-BP1及p-4E-BP1(T70)在SWOZ2和SWOZ2-BCNU細(xì)胞中的表達(dá)位置發(fā)現(xiàn)，總4E-BP1在2株細(xì)胞細(xì)胞核及細(xì)胞漿中呈均勻分布，見圖3A。磷酸化4E-BP1(T70)蛋白在SWOZ2細(xì)胞核、漿中也呈相對均勻分布，但在SWOZ2-BCNU細(xì)胞核中表達(dá)較細(xì)胞漿中明顯增強，見圖3B，說明p-4E-BP1(T70)蛋白在BCNU誘導(dǎo)耐藥的過程中逐漸出現(xiàn)了核轉(zhuǎn)位。使用核漿分離試劑盒分別檢測2株細(xì)胞核、漿中4E-BP1和p-4E-BP1(T70)蛋白含量，顯示SWOZ2-BCNU細(xì)胞核中 p-4E-BP1(T70)蛋白比細(xì)胞漿中明顯增多(P＜0.05)，見圖3C，與激光共聚焦顯微鏡檢測結(jié)果相符。這說明在藥物誘導(dǎo)的耐藥過程中4E-BP1不但出現(xiàn)了表達(dá)量的減少，其磷酸化蛋白還出現(xiàn)了核轉(zhuǎn)位。

Figure 3.Subcellular localization of 4E-BP1 and p-4E-BP1(T70)in SWOZ2 and SWOZ2-BCNU cells.A:localization of 4E-BP1 in SWOZ2 and SWOZ2-BCNU cells detected by laser confocal microscopy;B:localization of p-4E-BP1(T70)in SWOZ2 and SWOZ2-BCNU cells detected by laser confocal microscopy;C:expression of 4EBP1 and p-4E-BP1(T70)proteins in the cytosol and nucleus of SWOZ2 and SWOZ2-BCNU cells detected by Western blotting.Mean± SD.n=3.*P ＜0.05 vs SWOZ2 group.圖34E-BP1及p-4E-BP1(T70)在SWOZ2和SWOZ2-BCNU細(xì)胞中表達(dá)位置的差異

討 論

目前腦膠質(zhì)瘤主要以外科手術(shù)治療為主，由于腦膠質(zhì)瘤呈浸潤性生長且多處于腦部重要結(jié)構(gòu)，手術(shù)常無法徹底切除，因此化療成為腦膠質(zhì)瘤治療中必不可少的輔助治療方法。既往研究表明，腫瘤耐藥性的產(chǎn)生是基于多因素參與的復(fù)雜調(diào)控網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)。探究腦膠質(zhì)瘤耐藥的分子調(diào)控機制，尋找有效的逆轉(zhuǎn)耐藥的靶點，是改善腦膠質(zhì)瘤患者生存率的關(guān)鍵。

4E-BP1主要通過自身不同的磷酸化狀態(tài)來調(diào)節(jié)eIF4E的活性。在大多數(shù)細(xì)胞中p-4E-BP1(T70)在核漿中均有表達(dá)。但最近有研究發(fā)現(xiàn)，p-4E-BP1(T70)在子宮內(nèi)膜腺癌及HeLa細(xì)胞核中表達(dá)較細(xì)胞質(zhì)中明顯增加［14-15］。在本研究中SWOZ2細(xì)胞p-4EBP1(T70)蛋白在細(xì)胞核漿是相對均勻分布的，但在獲得性耐藥細(xì)胞株中p-4E-BP1(T70)蛋白在細(xì)胞核中的表達(dá)較細(xì)胞質(zhì)中明顯增加，說明磷酸化4E-BP1在獲得性耐藥過程中出現(xiàn)了向核內(nèi)轉(zhuǎn)移的現(xiàn)象。雖然我們對p-4E-BP1(T70)蛋白產(chǎn)生核轉(zhuǎn)位的機制仍不清楚，但這種蛋白質(zhì)定位的差異也間接暗示4EBP1參與了膠質(zhì)瘤獲得性耐藥的產(chǎn)生。

4E-BP1不但參與蛋白質(zhì)合成、細(xì)胞生長、增殖和代謝，最新的研究還發(fā)現(xiàn)其參與維持紡錘體和基因的穩(wěn)定性，具有調(diào)控線粒體呼吸功能等多重生物學(xué)活性［16-17］。也有研究報道4E-BP1表達(dá)水平與腫瘤的惡性度相關(guān)［18］。本研究結(jié)果顯示小干擾RNA下調(diào)SWOZ2細(xì)胞4E-BP1的表達(dá)后，細(xì)胞出現(xiàn)明顯的藥物抗性，模擬了獲得性耐藥細(xì)胞的改變。這說明獲得性耐藥細(xì)胞中4E-BP1表達(dá)下調(diào)不是一個邊緣現(xiàn)象，4EBP1可能是腦膠質(zhì)瘤獲得耐藥的關(guān)鍵蛋白，改變4EBP1的表達(dá)水平可以改變膠質(zhì)瘤的耐藥性。

為驗證體外實驗，課題組在臨床中尋找既有原發(fā)腫瘤標(biāo)本又有復(fù)發(fā)后組織標(biāo)本的病例，發(fā)現(xiàn)復(fù)發(fā)后腫瘤組織中4E-BP1表達(dá)有明顯減少趨勢。但由于惡性腦膠質(zhì)瘤生存期短，復(fù)發(fā)的組織標(biāo)本數(shù)有限，這部分?jǐn)?shù)據(jù)有待增大樣本量后再整理發(fā)表。

綜上所述，4E-BP1在人腦膠質(zhì)瘤獲得性耐藥細(xì)胞株中表達(dá)減少，通過小干擾RNA下調(diào)4E-BP1的表達(dá)能重復(fù)此現(xiàn)象，并且磷酸化4E-BP1在獲得性耐藥過程中出現(xiàn)了明顯的細(xì)胞定位改變，說明4E-BP1參與了人腦膠質(zhì)瘤獲得性耐藥，其耐藥的具體機制值得我們進(jìn)一步研究。

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