周天恩， 張 萌， 楊正飛， 蔣龍?jiān)?/p>

目前在臨床上亞低溫(31～32℃)已廣泛用于治療缺血、缺氧性腦病。亞低溫可通過(guò)降低腦組織氧耗量，抑制氧自由基生成和釋放以及抑制腦缺血缺氧后的炎性反應(yīng)對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)起保護(hù)作用，但其保護(hù)作用的分子機(jī)制尚不明確。近來(lái)有研究發(fā)現(xiàn)［1-2］，亞低溫可通過(guò)減少神經(jīng)元凋亡從而改善缺血、缺氧性腦病的神經(jīng)功能。細(xì)胞凋亡與caspase蛋白酶家族密切相關(guān)，所以亞低溫神經(jīng)保護(hù)作用的機(jī)制可能與 caspase蛋白酶家族相關(guān)。Caspase-3是caspase蛋白酶家族的重要成員之一，是執(zhí)行凋亡的重要效應(yīng)分子，本實(shí)驗(yàn)擬研究caspase-3在亞低溫減輕大鼠海馬神經(jīng)元氧糖剝奪(oxygen-glucose deprivation，OGD)損傷中的作用。

材料和方法

1 材料

1.1 動(dòng)物 SPF級(jí)健康新生(1～3 d)Sprague-Dawley(SD)大鼠，雌雄不限，由中山大學(xué)北校區(qū)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK(粵)2011-0029。將新生乳鼠消毒后剪開(kāi)頭皮與顱骨，分離取出海馬組織。

1.2 主要儀器 Galaxy A三氣培養(yǎng)箱 (RS Biotech);倒置熒光相差顯微鏡T2000U(Nikon);電子顯微鏡(中山大學(xué)北校區(qū)電子顯微鏡室);全自動(dòng)酶標(biāo)儀(Dragon);7600-010全自動(dòng)生化分析儀 (Hitachi);流式細(xì)胞儀 Facscalibur(Becton Dickinson);Anke TDL-40B高速離心機(jī)(上海安亭);低溫離心機(jī)(Eppendorf)。

1.3 主要試劑 DMEM/F12培養(yǎng)基 (Gibco);胎牛血清(HyClone);B27(Invitrogen);多聚賴氨酸(Sigma);阿糖胞苷(上海華聯(lián)公司);Triton X-100(Amresco);兔抗微管相關(guān)蛋白2(microtubule-associated protein 2，MAP2)多克隆抗體(Chemicon);山羊抗兔Cy3連接Ⅱ抗(Chemicon);Hoechst 33258(Sigma);臺(tái)盼藍(lán)(武漢博士德);胰蛋白酶(Sigma);碘化丙啶(propidium iodide，PI;Sigma);Annexin V-FITC 凋亡檢測(cè)試劑盒(Bender Medsystems);蛋白裂解液(Cell Signaling);caspase-3比色測(cè)定試劑盒(Biovision);PBS 液(自配):取 NaCl 8.00 g，KCl 0.20 g，Na2HPO4·H2O 1.56 g，KH2PO40.20 g，溶于三蒸水中，充分?jǐn)嚢枞芙夂?，加水? 000 mL，調(diào)節(jié)pH值7.4，微孔濾器過(guò)濾除菌;無(wú)糖Earle's液(自配):取NaCl 6.80 g，KCl 0.40 g，CaCl20.20 g，MgSO4·7H2O 0.20 g，NaH2PO4·2H2O 1.14 g，NaHCO32.20 g，溶于三蒸水，攪拌溶解，加水至1 000 mL，調(diào)節(jié) pH 值7.4，微孔濾器過(guò)濾除菌。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 0.1 g/L多聚賴氨酸包被培養(yǎng)皿3 d。取出生1～3 d SD乳鼠，消毒皮膚，依次剪開(kāi)頭皮與顱骨，迅速取出腦組織置于含4℃ PBS的培養(yǎng)皿。顯微鏡下分離海馬組織，放入含DMEM/F12培養(yǎng)基的離心管中輕柔吹打，以1 500 r/min離心5 min，棄上清液，加入含10%胎牛血清的DMEM/F12重懸細(xì)胞。臺(tái)盼藍(lán)計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)量，以1×109/L密度將細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿，置入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育。24 h后全量更換含2%B27的培養(yǎng)基，第3天加入5 μmol/L阿糖胞苷作用24 h，以后每3 d全量換液。觀察神經(jīng)元的生長(zhǎng)及細(xì)胞形態(tài)，第8天行神經(jīng)元MAP2免疫化學(xué)熒光鑒定。

2.2 實(shí)驗(yàn)分組及模型的建立 將實(shí)驗(yàn)細(xì)胞隨機(jī)分為4組(n=6):即為正常對(duì)照組、單純亞低溫組、單純OGD組和亞低溫+OGD組。通過(guò)設(shè)置培養(yǎng)箱溫度控制參數(shù)將亞低溫組培養(yǎng)箱內(nèi)溫度自動(dòng)控制在31～32℃。調(diào)設(shè)三氣培養(yǎng)箱至缺氧狀態(tài)(37℃，0.1%O2，5%CO2，94.5%N2)，以此模擬細(xì)胞缺氧。將培養(yǎng)第8天的海馬神經(jīng)元取出，吸出培養(yǎng)基，加入無(wú)糖Earle's液2 mL，以此模擬神經(jīng)元缺糖。本實(shí)驗(yàn)OGD時(shí)間為2 h，OGD后復(fù)氧、復(fù)糖24 h后處理送檢，非OGD組與OGD組同時(shí)處理送檢。

2.3 形態(tài)學(xué)觀察 將各組細(xì)胞復(fù)氧復(fù)糖24 h后，去除細(xì)胞培養(yǎng)液，固定15 min，用細(xì)胞刮子將細(xì)胞刮下，以2 000～3 000 r/min的速度低溫離心10 min，使細(xì)胞在離心管尖沉淀結(jié)塊。4℃保存送電子顯微鏡室觀察。

2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)神經(jīng)元凋亡 取各組細(xì)胞，復(fù)糖復(fù)氧24 h。胰酶消化后收集細(xì)胞離心，棄上清液，用結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，加入Annexin V-FITC和PI，混勻后避光室溫反應(yīng)15 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡率。凋亡率=早期凋亡率+中晚期凋亡率。

2.5 神經(jīng)元胞漿內(nèi)caspase-3活性檢測(cè) 提取細(xì)胞漿內(nèi)總蛋白，測(cè)定caspase-3的實(shí)際濃度，取200 μg caspase-3蛋白按caspase-3比色測(cè)定試劑盒要求處理，此后選擇405 nm波長(zhǎng)，在酶標(biāo)儀上測(cè)定各孔吸光度值。Caspase活性升高倍數(shù)=實(shí)驗(yàn)組A值/正常對(duì)照組A值。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，樣本均數(shù)間的比較采用方差分析，并行方差齊性檢驗(yàn)，兩組數(shù)據(jù)之間的相關(guān)研究采用直線相關(guān)分析。采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件完成，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 大鼠海馬神經(jīng)元培養(yǎng)與鑒定結(jié)果

培養(yǎng)第8天的大鼠海馬神經(jīng)元經(jīng)MAP2免疫熒光染色后置于熒光顯微鏡下用綠光激發(fā)，神經(jīng)元胞漿及軸突顯紅色熒光，膠質(zhì)細(xì)胞的胞漿及軸突和所有細(xì)胞核不染色，見(jiàn)圖1A;同時(shí)用Hoechst 33258進(jìn)行的非特異性細(xì)胞核熒光染色，所有細(xì)胞核(包括膠質(zhì)細(xì)胞核)染藍(lán)色，見(jiàn)圖1B。同一個(gè)視野2種染色結(jié)果比較后顯示海馬神經(jīng)元占所培養(yǎng)細(xì)胞的90%以上。

Figure 1.Fluorescence microscopic images(×200).A:immunofluorescence staining of microtubule-associated protein 2(MAP2)in rat hippocampal neurons;B:Hoechst 33258 fluorescence staining of nuclei in all isolated cells.圖1 MAP2免疫熒光染色及Hoechst 33258非特異性細(xì)胞核熒光染色結(jié)果

2 亞低溫減輕OGD所致海馬神經(jīng)元形態(tài)學(xué)損傷并

降低神經(jīng)元的凋亡率

各組海馬神經(jīng)元氧糖剝奪/復(fù)氧復(fù)糖培養(yǎng)24 h后分別用倒置光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，結(jié)果顯示，神經(jīng)元OGD后出現(xiàn)了胞體腫脹、包膜不完整、細(xì)胞器破壞等損傷表現(xiàn)，亞低溫干預(yù)后細(xì)胞損傷程度明顯減輕，見(jiàn)圖2、3。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，單純亞低溫組的神經(jīng)元凋亡率(12.5% ±2.4%)與正常對(duì)照組神經(jīng)元凋亡率(14.2% ±2.9%)比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;神經(jīng)細(xì)胞OGD后凋亡率明顯升高，單純OGD組神經(jīng)元凋亡率(42.9% ±4.3%)與亞低溫+OGD組神經(jīng)元凋亡率(28.3% ±3.2%)均明顯高于正常對(duì)照組(P＜0.01);亞低溫+OGD組與單純OGD組比較，神經(jīng)元凋亡率下降，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)，見(jiàn)圖4。

Figure 2.The morphology of rat hippocampal neurons 24 h after reoxygenation and glucose reintroduction observed under light microscope(×400).A:control group;B:mild hypothermia group;C:OGD group;D:mild hypothermia+OGD group.圖2 各組大鼠海馬神經(jīng)元復(fù)氧復(fù)糖24 h后的形態(tài)學(xué)變化

Figure 3.The ultrastructure of rat hippocampal neurons 24 h after reoxygenation and glucose reintroduction observed under electron microscope(×15 500～21 000).A:control group;B:mild hypothermia group;C:OGD group;D:mild hypothermia+OGD group.圖3 各組大鼠海馬神經(jīng)元復(fù)氧復(fù)糖24 h后超微結(jié)構(gòu)的變化

3 亞低溫降低神經(jīng)元凋亡率的同時(shí)降低神經(jīng)元胞漿內(nèi)caspase-3活性

單純亞低溫組caspase-3活性(121% ±17%)與正常對(duì)照組caspase-3活性(100% ±14%)比較無(wú)顯著差異;神經(jīng)細(xì)胞OGD后caspase-3活性明顯升高，單純OGD組caspase-3活性(353% ±31%)和亞低溫+OGD組caspase-3活性(225% ±24%)均明顯高于正常對(duì)照組(P＜0.01);亞低溫+OGD組與單純OGD組比較，caspase-3活性下降，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)，見(jiàn)圖5。

4 OGD后神經(jīng)元凋亡率與神經(jīng)元胞漿內(nèi)caspase-3活性的相關(guān)性分析結(jié)果

OGD 2 h后神經(jīng)元凋亡率(42.9% ±4.3%)與神經(jīng)元胞漿內(nèi)caspase-3活性(353% ±31%)呈顯著正相關(guān)(r=0.823，P ＜0.05);亞低溫 +OGD 2 h 后神經(jīng)元凋亡率(28.3% ±3.2%)與神經(jīng)元胞漿內(nèi)caspase-3活性(225% ±24%)亦呈顯著正相關(guān)(r=0.841，P ＜0.05)。

Figure 4.The apoptosis of rat hippocampal neurons detected by flow cytometry.A:control group;B:mild hypothermia group;C:OGD group;D:mild hypothermia+OGD group.Mean ±SD.n=6.＊＊P ＜0.01 vs control group;#P ＜0.05 vs OGD group.圖4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組大鼠海馬神經(jīng)元的凋亡

Figure 5.Comparison of caspase-3 activity in the cytoplasm of rat hippocampal neurons.Mean ± SD.n=6.＊＊P ＜0.01 vs control group;#P ＜0.05 vs OGD group.圖5 各組大鼠海馬神經(jīng)元胞漿內(nèi)caspase-3活性比較

討 論

1 神經(jīng)元OGD損傷模型的方法學(xué)評(píng)價(jià)

體外培養(yǎng)的神經(jīng)細(xì)胞保留了體內(nèi)神經(jīng)元的相關(guān)生理特性，目前已被廣泛培養(yǎng)用來(lái)代替體內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究［3-6］。體外OGD模型與體內(nèi)模型相比，其能更簡(jiǎn)單、更準(zhǔn)確地控制細(xì)胞外環(huán)境，因此常用來(lái)研究缺血、缺氧引起的生物化學(xué)及細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變，亦常用來(lái)研究相關(guān)的分子生物學(xué)機(jī)制［7］。目前用OGD模型模擬體內(nèi)神經(jīng)元缺血、缺氧是研究的熱點(diǎn)，此模型目前已被廣泛用來(lái)研究缺血、缺氧性腦?。?-11］。

2 亞低溫對(duì)OGD損傷神經(jīng)元的保護(hù)作用

目前亞低溫仍是腦缺血、缺氧損傷后治療的關(guān)鍵。在臨床研究方面，Yokoyama等［12］在日本進(jìn)行了一個(gè)多中心調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)，452個(gè)心肺復(fù)蘇后恢復(fù)自主循環(huán)的患者均接受了亞低溫治療，中心體溫控制在(33.9 ±0.4)℃，持續(xù)時(shí)間(31.5 ±13.9)h，結(jié)果發(fā)現(xiàn)30 d后存活率為80.1%，具有良好神經(jīng)功能的比例有55.3%，這明顯高于既往報(bào)道的未接受低溫治療的患者。在大體動(dòng)物研究方面，有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)［13］，在失血性休克大鼠模型中，33℃的亞低溫治療能明顯提高生存率。Noguchi等［14］在沙鼠全腦缺血模型中研究發(fā)現(xiàn)，亞低溫可抑制缺血/再灌注損傷及細(xì)動(dòng)脈血管收縮，從而改善全腦缺血損傷的存活率。在體外培養(yǎng)的動(dòng)物神經(jīng)細(xì)胞方面，Dalen等［15］在體外培養(yǎng)的神經(jīng)細(xì)胞OGD模型中研究發(fā)現(xiàn)，亞低溫能明顯提高神經(jīng)元OGD后的存活率并減少炎癥介質(zhì)的生成，且其保護(hù)作用與復(fù)氧后氧濃度的高低無(wú)關(guān)。Liu等［16］在體外培養(yǎng)的大鼠腦切片OGD模型中研究發(fā)現(xiàn)，亞低溫能改善細(xì)胞的新陳代謝，且低溫時(shí)機(jī)越早越好。

本研究發(fā)現(xiàn)，亞低溫干預(yù)能明顯減輕OGD導(dǎo)致的神經(jīng)元損傷，包括改善神經(jīng)元的形態(tài)，以及降低神經(jīng)元的凋亡率。但是亞低溫具有潛在的副作用，其具體溫度的控制和亞低溫治療的時(shí)間仍需要更進(jìn)一步的研究。

3 亞低溫對(duì)OGD損傷神經(jīng)元保護(hù)的分子機(jī)制

亞低溫可通過(guò)減少神經(jīng)元凋亡從而改善缺血、缺氧性腦病的神經(jīng)功能，而細(xì)胞凋亡與caspase家族密切相關(guān)。Caspase是一個(gè)半胱氨酸蛋白酶家族，在細(xì)胞凋亡的過(guò)程中起著關(guān)鍵性的作用，是凋亡的共同通路，其成員是caspase-3執(zhí)行凋亡的重要效應(yīng)分子，激活caspase-3之前稱(chēng)為凋亡的可逆階段，之后稱(chēng)為凋亡的不可逆階段。因此，降低caspase-3的活性可以有效抑制凋亡的發(fā)生發(fā)展。由于caspase-3與凋亡有密切的相關(guān)性，很多學(xué)者已將caspase-3作為檢測(cè)指標(biāo)，用來(lái)評(píng)估某方法或藥物對(duì)大腦缺血、缺氧性損傷的治療效果［17-20］。有研究表明，亞低溫可抑制缺血再灌注損傷引起的 caspase-3活化［21］，可降低H2O2誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷中的 caspase-3活性［22］，還可減少缺血、缺氧性腦病新生兒血清中的caspase-3活性［23］。因此，亞低溫治療可能是通過(guò)降低缺氧缺血后caspase-3的活性，從而起到腦保護(hù)作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)細(xì)胞OGD后caspase-3活性明顯升高，與神經(jīng)元凋亡率升高呈正相關(guān)，這說(shuō)明神經(jīng)細(xì)胞OGD后可能通過(guò)激活caspase-3，從而引發(fā)神經(jīng)元程序性死亡，導(dǎo)致凋亡明顯增加;亞低溫+OGD組與單純OGD組比較，caspase-3活性下降，同時(shí)神經(jīng)元凋亡率亦明顯下降，說(shuō)明亞低溫可能通過(guò)降低caspase-3活性從而抑制神經(jīng)元的凋亡。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，降低caspase-3活性是亞低溫對(duì)神經(jīng)元OGD損傷保護(hù)作用的分子機(jī)制之一。亞低溫對(duì)OGD損傷的保護(hù)作用的分子機(jī)制極其復(fù)雜，目前尚未完全明了，需要進(jìn)一步研究。

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