朱 寧， 林繼宗， 陳慶狀， 韋美丹， 王 勇△

阿爾茨海默病(Alzheimer disease，AD)是以認(rèn)知功能進行性下降和情感障礙為特點的神經(jīng)退行性疾病［1］。淀粉樣 β 肽(amyloid beta-peptide，Aβ)沉積激活小膠質(zhì)細(xì)胞引起的炎癥反應(yīng)是導(dǎo)致AD患者腦內(nèi)神經(jīng)損傷和凋亡的重要原因。研究報道，從中藥千層塔中分離得到的一種石松類生物堿——石杉堿甲(huperzine A，HupA)，為乙酰膽堿酯酶抑制劑，在AD治療中效果顯著［2］。但HupA的其它AD治療機制尚不完全清楚，且目前關(guān)于HupA治療AD的研究靶點主要局限于已經(jīng)成熟的功能性細(xì)胞［3-4］，很少關(guān)注HupA對神經(jīng)細(xì)胞生成的影響，更少研究HupA對神經(jīng)干細(xì)胞的作用。因此，本研究將建立大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞與神經(jīng)干細(xì)胞共培養(yǎng)體系，在小膠質(zhì)細(xì)胞層中加入Aβ1-42模擬AD患者腦內(nèi)炎性微環(huán)境，觀察HupA對炎癥反應(yīng)的作用，同時檢測神經(jīng)干細(xì)胞凋亡率，明確HupA對神經(jīng)干細(xì)胞的保護作用。

材料和方法

1 主要試劑及材料

新生SD大鼠(出生24 h內(nèi))由南方醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，許可證號為SCXK(粵)2011-0015。OX-42和 nestin I抗(Abcam)，抗小鼠 II抗(R＆D Systems)，0.4 μm Transwell培養(yǎng)板(Corning)，Aβ1-42(US Biological)，大鼠細(xì)胞因子檢測試劑盒(LINCO)，Bcl-2、Bax和 β-actin I抗(Cell Signaling)，核蛋白提取試劑盒(凱基)。

2 主要方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

2.1.1 神經(jīng)干細(xì)胞的培養(yǎng) 取新生SD大鼠海馬，胰酶消化20 min，然后用10%FBS終止消化，過濾。濾液離心，細(xì)胞沉淀用含EGF、bFGF和B27的培養(yǎng)液重懸，調(diào)整細(xì)胞密度至1×109/L，接種，每隔3～4 d 半量換液［5］。

2.1.2 小膠質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng) 取新生SD大鼠海馬，制成單細(xì)胞懸液以5×108/L的細(xì)胞密度接種于預(yù)先經(jīng)多聚賴氨酸包被處理的培養(yǎng)瓶中，2 d后全量換液，待培養(yǎng)至9～10 d，手搖法分離純化小膠質(zhì)細(xì)胞［6］。

2.1.3 免疫熒光染色鑒定小膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)干細(xì)胞 4%多聚甲醛固定細(xì)胞15 min;山羊血清封閉30 min，加入nestin I抗檢測神經(jīng)干細(xì)胞，或加OX-42 I抗檢測小膠質(zhì)細(xì)胞，4℃過夜，PBS漂洗，加入FITC(綠光)或TRITC(紅光)標(biāo)記的II抗，避光孵育1 h，DAPI染核5 min，熒光顯微鏡拍照。

2.1.4 共培養(yǎng)體系的建立 Transswell共培養(yǎng)體系的建立參照本課題組前期研究方法進行［6］。

2.2 實驗分組 實驗分3組，所有操作平行進行。(1)空白對照組(control):神經(jīng)干細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞以1∶1的比例依次接種于Transwell板的上層和下層;(2)Aβ組:細(xì)胞培養(yǎng)方法同空白對照組，于小膠質(zhì)細(xì)胞層中加入終濃度為10 μmol/L的Aβ1-42;(3)HupA組:細(xì)胞培養(yǎng)方法同空白對照組，在小膠質(zhì)細(xì)胞層中加入 10 μmol/L Aβ1-42前 4 h 用1 μmol/L HupA預(yù)處理小膠質(zhì)細(xì)胞［7］。各組培養(yǎng)24、48和72 h后檢測白細(xì)胞介素6(interleukin 6，IL-6)、腫瘤壞死因子 α(tumor necrosis factor α，TNF-α)和巨噬細(xì)胞炎癥蛋白 1α(macrophage inflammatory protein 1α，MIP-1α)的濃度，72 h后用流式細(xì)胞術(shù)和 Western blotting檢測神經(jīng)干細(xì)胞的凋亡情況。

2.3 液相芯片檢測 IL-6、TNF-α和MIP-1α的表達(dá)

相對于ELISA技術(shù)，液相芯片技術(shù)具有高通量、檢測過程簡單快速、準(zhǔn)確性高和重復(fù)性好等特點。收集各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液，依照LINCOplex Kit說明書檢測IL-6、TNF-α和MIP-1α濃度，主要步驟為:檢測試劑恢復(fù)到室溫，在測定板上滴加Buffer封閉濾板，室溫振搖10 min;分別加25 μL細(xì)胞培養(yǎng)上清液、梯度稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品、空白和質(zhì)控品到相應(yīng)孔中;加混合微球，在振蕩器上室溫孵育2 h，用Wash buffer洗板2次，然后每孔加檢測抗體的混合液，在振蕩器上室溫孵育2 h;加抗生物素蛋白鏈菌素，孵育30 min;洗板后加檢測液，用Luminex液相芯片分析系統(tǒng)檢測炎癥因子濃度。

2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測神經(jīng)干細(xì)胞凋亡率 收集各組神經(jīng)干細(xì)胞，參照annexin V-FITC/PI檢測試劑盒說明書進行前期處理，用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率。

2.5 Western blotting檢測Bcl-2和Bax表達(dá) 收集細(xì)胞，采用細(xì)胞核蛋白提取試劑盒提取各組神經(jīng)干細(xì)胞核蛋白，BCA法蛋白定量，計算上樣量，按SDSPAGE凝膠電泳跑膠后，采用半干法轉(zhuǎn)膜，經(jīng)封閉，Bcl-2、Bax和β-actin I抗孵育，II抗孵育后顯影。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件分析，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。多組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)，組間兩兩比較采用最小顯著性差異法(LSD)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 神經(jīng)干細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞的鑒定

以DAPI和小膠質(zhì)細(xì)胞特異性標(biāo)志物OX-42進行熒光雙染，鑒定培養(yǎng)小膠質(zhì)細(xì)胞的純度，結(jié)果顯示，所培養(yǎng)的小膠質(zhì)細(xì)胞呈OX-42染色陽性且純度大于95%，符合實驗要求(圖1A)。神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)志物nestin對成形細(xì)胞球的檢測結(jié)果顯示nestin染色陽性(圖1B)。

2 HupA 抑制IL-6、TNF-α和 MIP-1α分泌

各組細(xì)胞處理 48 h后，Aβ組 IL-6、TNF-α和MIP-1α的濃度分別升高至空白對照組的3.8、4.6和4.9倍(P＜0.01)，且相對于24 h的濃度亦顯著升高;HupA組的IL-6、TNF-α和MIP-1α的濃度分別升至空白對照組的2.2、1.6 和2.4 倍，相對于 Aβ 組顯著降低(P＜0.01)。而在72 h后，Aβ組IL-6、TNF-α和MIP-1α的釋放量分別增至空白對照組的6.7、6.8和9.6倍(P ＜0.01);HupA 組 IL-6、TNF-α 和 MIP-1α的濃度分別為空白對照組的3.2、2.3和3.1倍，相對于Aβ組顯著降低(P＜0.01)，見圖2。

Figure 1.Identification of microglia and neural stem cells(NSCs).A:the microglial cells were positive for OX-42 staining(green);B:the NSCs were positive for nestin staining(red).圖1 小膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)干細(xì)胞的鑒定

Figure 2.Huperzine A(HupA)reduced the secretion of IL-6(A)，TNF-α (B)and MIP-1α (C).Mean±SD.n=6.＊＊P ＜0.01 vs control;##P＜0.01 vs Aβ.圖2 石杉堿甲減少IL-6、TNF-α和MIP-1α分泌

3 HupA降低神經(jīng)干細(xì)胞凋亡率

流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，細(xì)胞處理72 h后，空白對照組神經(jīng)干細(xì)胞凋亡率為3.04%;當(dāng)小膠質(zhì)細(xì)胞層中加入 Aβ1-42后，神經(jīng)干細(xì)胞凋亡率升高至25.46%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (P＜0.01);在Aβ1-42加入前用HupA預(yù)處理小膠質(zhì)細(xì)胞，神經(jīng)干細(xì)胞凋亡率降低至8.05%，與 Aβ組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，見圖3。

4 HupA升高神經(jīng)干細(xì)胞的Bcl-2/Bax值

Western blotting檢測結(jié)果顯示，細(xì)胞處理72 h后，Aβ組Bcl-2和Bax蛋白相對于β-actin的表達(dá)量最高，而Bcl-2/Bax值最低(P＜0.01);在Aβ1-42加入前預(yù)先用HupA處理小膠質(zhì)細(xì)胞，Bcl-2/Bax值顯著升高，與Aβ組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，見圖4。

討 論

Figure 3.HupA reduced the apoptotic rate of NSCs.The apoptosis of NSCs was detected by flow cytometry.Mean±SD.n=6.＊＊P ＜0.01 vs control;##P＜0.01 vs Aβ.圖3 石杉堿甲降低神經(jīng)干細(xì)胞凋亡率

Figure 4.HupA elevated the Bcl-2/Bax ratio in NSCs.The expression of Bcl-2 and Bax was detected by Western blotting.Mean± SD.n=6.＊＊P ＜0.01 vs control;#P ＜0.05 vs Aβ.圖4 石杉堿甲對Bcl-2/Bax比值的影響

AD患者腦組織中聚積的Aβ持續(xù)作用于膠質(zhì)細(xì)胞，形成的慢性炎癥反應(yīng)，誘發(fā)神經(jīng)元凋亡和抑制神經(jīng)細(xì)胞生成，造成中樞神經(jīng)細(xì)胞大量丟失。這可能是AD形成和病情加重的主要原因。HupA作為一種膽堿酯酶抑制劑，已在臨床應(yīng)用治療AD，且有一定療效。有研究提示HupA可能作用于膽堿能受體而減弱炎性反應(yīng)［8］。本課題組采用Transwell裝置在體外成功建立了神經(jīng)干細(xì)胞與小膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)體系，在小膠質(zhì)細(xì)胞中加入Aβ1-42模擬AD患者腦內(nèi)炎癥微環(huán)境，以此探討HupA的抗炎作用與神經(jīng)干細(xì)胞保護作用。研究發(fā)現(xiàn)，在Aβ1-42的刺激下，小膠質(zhì)細(xì)胞分泌 IL-6、TNF-α和 MIP-1α，炎癥因子穿過 Tran swell半透膜，引起神經(jīng)干細(xì)胞的凋亡。IL-6是一種具有多向性的細(xì)胞因子，在AD中大量表達(dá)，能通過誘導(dǎo)磷脂酶A2基因表達(dá)促進炎癥反應(yīng)。而TNF-α是在炎癥反應(yīng)中引發(fā)和調(diào)節(jié)細(xì)胞因子級聯(lián)反應(yīng)的重要促炎細(xì)胞因子，它能夠刺激IL-1等多種細(xì)胞因子的表達(dá)，這些細(xì)胞因子反過來經(jīng)各種機制持續(xù)放大炎性反應(yīng)［9］。因此，抑制 TNF-α和 IL-6的產(chǎn)生對AD慢性炎癥反應(yīng)的控制和微環(huán)境的改善有重要作用。不同于TNF-α和IL-6，MIP-1α是趨化因子C-C超家族中的一種，其趨化作用在AD中引起小膠質(zhì)細(xì)胞向Aβ斑塊周圍的聚集，小膠質(zhì)細(xì)胞受Aβ的刺激釋放包括MIP-1α在內(nèi)的各種炎癥因子，形成一個惡性循環(huán)［10］。在HupA的作用下，小膠質(zhì)細(xì)胞分泌的IL-6、TNF-α和MIP-1α顯著減少，產(chǎn)生明顯的抗炎作用。以往研究顯示這種作用是由于HupA抑制膽堿酯酶活性，增加乙酰膽堿水平，激活膽堿能受體后下調(diào)細(xì)胞因子和趨化因子的表達(dá)而產(chǎn)生的［8，11-12］。而我們的研究表明，HupA可直接作用于小膠質(zhì)細(xì)胞，減少小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥因子的分泌，從而抑制炎癥反應(yīng)。

HupA治療AD效果顯著。有研究顯示其可通過減少Aβ的產(chǎn)生和作用于神經(jīng)生長因子信號通路對神經(jīng)元起保護作用［7］，而本研究重點關(guān)注了HupA對神經(jīng)干細(xì)胞的保護作用。流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果提示，HupA可通過作用于小膠質(zhì)細(xì)胞，降低神經(jīng)干細(xì)胞凋亡率，從而保護神經(jīng)干細(xì)胞。同時，Western blotting檢測發(fā)現(xiàn)，HupA組神經(jīng)干細(xì)胞Bcl-2/Bax值較Aβ組高。Bcl-2是重要的細(xì)胞凋亡抑制蛋白;Bax是Bcl-2蛋白家族中的一種，可拮抗Bcl-2的保護作用。Bcl-2蛋白家族中促凋亡和抑凋亡兩類蛋白的比例決定細(xì)胞在受到凋亡信號刺激后是否發(fā)生凋亡。當(dāng)Bcl-2/Bax值降低，Bax形成同源二聚體誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡;而當(dāng)Bcl-2/Bax值增高時，Bax與Bcl-2形成異源二聚體，實現(xiàn)Bcl-2抑制細(xì)胞凋亡的功能［13］。我們發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)干細(xì)胞在Aβ1-42介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)刺激下，Bcl-2和 Bax表達(dá)量是各組中最高的，而Bcl-2/Bax值是各組中最低的。HupA預(yù)處理小膠質(zhì)細(xì)胞后，液相芯片檢測發(fā)現(xiàn)炎癥因子分泌減少，同時，Bcl-2/Bax值顯著高于Aβ組，產(chǎn)生抑制神經(jīng)干細(xì)胞凋亡的作用。Western blotting和流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果均提示HupA可抑制神經(jīng)干細(xì)胞的凋亡。HupA減少炎癥因子分泌，降低神經(jīng)干細(xì)胞凋亡率，對神經(jīng)細(xì)胞的生存具有積極意義。因此，HupA治療AD的機制之一可能是通過直接作用于小膠質(zhì)細(xì)胞，抑制小膠質(zhì)細(xì)胞分泌細(xì)胞因子和趨化因子，減弱炎癥反應(yīng)，改善神經(jīng)細(xì)胞生長的微環(huán)境并促進神經(jīng)細(xì)胞的存活。然而HupA作用于小膠質(zhì)細(xì)胞的具體信號通路及機制還有待進一步探索。

綜上所述，HupA可以抑制小膠質(zhì)細(xì)胞分泌細(xì)胞因子和趨化因子，改善炎癥微環(huán)境，并減少神經(jīng)干細(xì)胞的凋亡，產(chǎn)生神經(jīng)保護作用，為AD的神經(jīng)干細(xì)胞療法提供了實驗基礎(chǔ)。

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