牛忠杰，暢繼武

（天津醫(yī)科大學第二醫(yī)院泌尿外科，天津市泌尿外科研究所，天津 300211）

精原細胞瘤是睪丸最常見的惡性腫瘤，腫瘤間質(zhì)中伴有較多淋巴細胞浸潤。筆者采用免疫組織化學方法對72例精原細胞瘤間質(zhì)中浸潤的淋巴細胞CD3、CD4、CD8、CD25 的表達情況進行檢測，研究腫瘤中細胞免疫情況。

1 資料和方法

1.1 臨床資料 72例患者均為1988-2012年于本院住院行手術(shù)治療的患者，均經(jīng)病理證實為精原細胞瘤，所有患者術(shù)前均未接受放療、化療及免疫治療。經(jīng)典型精原細胞瘤51例，臨床I 期38例，II 期13例；間變型精原細胞瘤21例，臨床I 期13例，II期8例；患者平均年齡24～67 歲，中位年齡43 歲。病變的睪丸左側(cè)30例，右側(cè)42例。

1.2 方法

1.2.1 切片 腫瘤組織常規(guī)石蠟包埋后，每個標本連續(xù)切取4μm 厚白片4 張，分別進行CD3、CD8、CD4 及CD25 染色。

1.2.2 主要試劑 鼠抗人CD3 單克隆抗體，兔抗人CD4 單克隆抗體，兔抗人CD8 單克隆抗體，鼠抗人CD25 單克隆抗體及通用型PV6000 HRP 多聚體二抗均購自中杉金橋公司。

1.2.3 免疫組織化學染色步驟 應用免疫組織化學SP 法染色。石蠟切片常規(guī)脫蠟和水化后,使用微波爐修復，恢復室溫后用PBS 洗滌；使用3%H2O2封閉內(nèi)源性過氧化物酶；PBS 洗滌；滴加一抗，放入4℃冰箱孵育過夜；PBS 洗滌；滴加二抗試劑，室溫下孵育20 min；PBS 洗滌；DAB 顯色，顯微鏡下觀察并終止顯色；自來水沖洗；蘇木素復染；梯度乙醇脫水；二甲苯透明及中性樹膠封片。

1.3 結(jié)果判讀 CD3+、CD4+、CD8+、CD25+T 細胞判斷標準：細胞形態(tài)完整，結(jié)構(gòu)清晰，細胞膜上有棕黃色顆粒附著,如圖1～4。連續(xù)切片中，在相同部位出現(xiàn)CD4、CD25 陽性標記的細胞即為調(diào)節(jié)性T 細胞（T regulatory，Treg）。采用盲法進行觀察，先用低倍鏡觀察整張切片，每張玻片隨機選擇10個高倍視野（400×）計數(shù)陽性細胞，并且求平均值。

1.4 統(tǒng)計學方法 應用SPSS15.0 統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行處理。對CD3+T 細胞、CD4+T 細胞、CD8+T 細胞、Treg 的分組計量，結(jié)果以±s 形式表示。以t 檢驗方法對數(shù)據(jù)進行檢驗，檢驗水準取α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 T 淋巴細胞亞群在不同分期的經(jīng)典型精原細胞瘤中表達 相比較于I 期，II 期患者的CD3+T 淋巴細胞、CD4+T 淋巴細胞及CD4+/CD8+比值均下降，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），CD8+T 淋巴細胞及調(diào)節(jié)性T 淋巴細胞數(shù)值均升高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），見表1。

表1 經(jīng)典型精原細胞瘤間質(zhì)中T 淋巴細胞亞群活性比較Tab 1 Comparison of the result of T cell subtypes among different stages of classical seminoma

2.2 T 淋巴細胞亞群在不同分期的間變型精原細胞瘤中表達 研究結(jié)果顯示，間變型精原細胞瘤隨腫瘤進展，腫瘤間質(zhì)中CD3+T 淋巴細胞、CD4+T 淋巴細胞及CD4+/CD8+比值都下降，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），而CD8+T 淋巴細胞及調(diào)節(jié)性T 淋巴細胞則升高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），見表2。

表2 間變型精原細胞瘤間質(zhì)中T 淋巴細胞亞群活性比較Tab 2 Comparison of the result of T cell subtypes among different stages of anaplastic seminoma

3 討論

腫瘤的發(fā)生、發(fā)展不僅是腫瘤細胞內(nèi)在的特性反應，而且與腫瘤微環(huán)境中的非腫瘤成分有一定關(guān)系[1-2]。非腫瘤成分中的免疫細胞在腫瘤進展中發(fā)揮一定作用。據(jù)腫瘤免疫編輯學說，腫瘤細胞在機體內(nèi)發(fā)生、發(fā)展是一個免疫系統(tǒng)與腫瘤細胞相互作用的動態(tài)過程，當機體免疫能力降低，不能有效清除、抵制腫瘤細胞時，腫瘤會加速生長[3]。腫瘤免疫以細胞免疫為主，其中T 細胞發(fā)揮主要作用。T 細胞通過各個亞群之間的協(xié)同作用發(fā)揮效應，隨腫瘤進展，受多種因素影響，免疫系統(tǒng)中T 細胞亞群失衡，造成機體對腫瘤的免疫耐受。

T 細胞亞群中的CD4+T 細胞不僅可以激活腫瘤特異性細胞毒性T 淋巴細胞，還可活化免疫系統(tǒng)中其他效應細胞如B 細胞、巨噬細胞等，從多方面增強細胞免疫，誘導多種效應細胞殺傷腫瘤細胞，調(diào)節(jié)免疫反應的活性。Perdz-Diez 等[4]研究顯示在小鼠B6 膀胱癌模型中，腫瘤特異性CD4+T 細胞發(fā)揮比CD8+T 細胞更重要的抗腫瘤效應。在本研究中，II 期患者，CD4+T 細胞數(shù)量與I 期相比明顯減少（P<0.05），提示精原細胞瘤間質(zhì)中，抗腫瘤免疫效應降低。CD8+T 淋巴細胞可以特異性直接殺傷腫瘤細胞，精原細胞瘤，無論是經(jīng)典型精原細胞瘤還是間變型精原細胞瘤，II 期患者標本中CD8+T 細胞數(shù)目有所增加（P<0.05），這與Hadrup 等[5]的研究結(jié)果一致，但腫瘤間質(zhì)中的CD8+T 細胞能否發(fā)揮有效的細胞毒作用還有待進一步研究。精原細胞瘤間質(zhì)CD4+T/CD8+比值降低，II 期精原細胞瘤CD4+T/CD8+比值降低更加明顯，提示T 細胞介導的免疫抑制加重。腫瘤間質(zhì)中T 淋巴細胞數(shù)量異常，各亞群比例失衡，改變了組織局部免疫微環(huán)境，免疫功能減弱，有利于腫瘤細胞增殖。調(diào)節(jié)性T 細胞是一群具有免疫負調(diào)控能的T 細胞亞群，可通過分泌IL-10、轉(zhuǎn)化生長因子-β 及細胞接觸等多種方式發(fā)揮作用[6]。Liyanage[7]檢測乳腺癌、胰腺癌和正常人的外周血淋巴細胞、腫瘤浸潤淋巴細胞（TIL）和腫瘤區(qū)域淋巴結(jié)中Treg 的比重發(fā)現(xiàn)，癌癥患者體內(nèi)Treg 顯著高于正常人，而在TIL、區(qū)域淋巴結(jié)中Treg 比重分別為20.2%和20.1%。本研究結(jié)果提示，在精原細胞瘤中也能見到Treg 散在分布，且隨著精原細胞瘤腫瘤臨床分期進展，腫瘤間質(zhì)中Treg 細胞數(shù)量增多，Treg 的浸潤也在一定程度上反應了機體的腫瘤免疫受到抑制。

近年來，腫瘤的免疫治療包括腫瘤疫苗以及TIL細胞過繼免疫治療已經(jīng)過大量的試驗，但其抗腫瘤作用仍有限。研究表明，通過去除機體Treg 細胞可以提高腫瘤疫苗的抗瘤效應，進一步了解Treg 細胞調(diào)節(jié)機制可能會提供更有效的抗腫瘤免疫療法。

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［3］Dunn G P,Bruce A T,Ikeda H,et al.Cancer immunoediting：from Immuno-surveillance to tumor escape[J].Nat Immunol,2002,3（11）：991

［4］Perez-Diez A,Joncker N T,Choi K,et al.CD4 cells can be more efficient at tumor rejection than CD8 cells [J].Blood,2007,109（12）：5346

［5］Hadrup S R,Braendstrup O,Jacobsen G K,et al.Tumor infil-trating lymphocytes in seminoma lesions comprise clonally expanded cytotoxic T cells[J].Int J Cancer,2006,119（4）:831

［6］Nishikawa H,Sakaguchi S.Regulatory T cells in tumor immunity[J].Int J Cancer,2010,127（4）:759

［7］Liyanage U K,Moore T T,Joo H G,et al.Prevalence of regulatory T cells is increased in peripheral blood and tumor microenvironment of patients with pancreas or breast adenocarcinoma[J].J Immunol，2002，169（5）：2756