朱 凱

(重慶第二師范學(xué)院生化系，重慶400067)

藥品中有效成分的定量分析是藥物質(zhì)量控制的重要研究領(lǐng)域，其定量分析結(jié)果是否準(zhǔn)確可靠直接決定了藥物的安全性和有效性。傳統(tǒng)上判定測(cè)量結(jié)果是否準(zhǔn)確，主要是通過測(cè)量誤差來表示。近些年，國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化組織(ISO)制定了《測(cè)量不確定度表達(dá)指南》，方法能夠更客觀、準(zhǔn)確的評(píng)價(jià)測(cè)定結(jié)果的質(zhì)量，不確定度是測(cè)量的重要質(zhì)量特性之一［1，2］。在分析測(cè)量中，不確定度評(píng)價(jià)正在成為一種常規(guī)要求［3］。不確定度越小，則測(cè)量方法水平越高，其測(cè)量的結(jié)果使用價(jià)值越大。測(cè)量的不確定度是定量分析結(jié)果中重要組成部分之一，可用于評(píng)估定量方法是否可靠，測(cè)量結(jié)果是否可信。雙氫青蒿素哌喹片為雙氫青蒿素和磷酸哌喹組成的復(fù)方片劑，是一種治療瘧疾的優(yōu)良藥物［4，5］。雙氫青蒿素及磷酸哌喹均為中國(guó)藥典(2010年版)收載［6］。對(duì)HPLC法測(cè)定雙氫青蒿素哌喹片中雙氫青蒿素含量的不確定度構(gòu)成進(jìn)行分析，計(jì)算不確定度的大小，為評(píng)價(jià)HPLC法測(cè)定片劑含量的結(jié)果、提高測(cè)定質(zhì)量提供科學(xué)依據(jù)和參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Shimadzu LC-2010A高效液相色譜儀(包括自動(dòng)進(jìn)樣器)，SPD-M10Avp二極管陣列檢測(cè)器，CLASS-VP色譜工作站;Mettler AE240電子分析天平。

雙氫青蒿素哌喹片(重慶華立控股股份有限公司，每片含雙氫青蒿素40 mg、磷酸哌喹0.32 g，批號(hào)20050403)，雙氫青蒿素對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，含量100.0%，批號(hào)100184-200401)，乙腈、甲醇為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

(1)色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)。色譜柱為Phenomenex C18(250 mm×4.6 mm，5μm)，流動(dòng)相為乙腈-甲醇 -0.02 mol/L硫酸銨(50∶10∶40，稀硫酸調(diào) pH4.8)，流速1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量10μL。理論板數(shù)按雙氫青蒿素α異構(gòu)體峰或β異構(gòu)體峰計(jì)算均不低于10 000。

(2)測(cè)定法。取雙氫青蒿素哌喹片10片，精密稱定，研細(xì)，精密稱取適量(約相當(dāng)于雙氫青蒿素20 mg)，置25 mL量瓶中，加甲醇約20 mL，振搖5 min，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，靜置30 min，作為供試品溶液;另取雙氫青蒿素對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇溶解并定量稀釋制成每1 mL中約含0.8 mg的溶液，靜置30 min，作為對(duì)照溶液。精密量取供試品溶液與對(duì)照溶液各10μL，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按外標(biāo)法以α異構(gòu)體和β異構(gòu)體的峰面積之和計(jì)算供試品中雙氫青蒿素的含量。

2 測(cè)量不確定度的分析

2.1 測(cè)量不確定度的構(gòu)成及相對(duì)合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度的數(shù)學(xué)表達(dá)式

根據(jù)HPLC外標(biāo)法以峰面積計(jì)算含量的基本原理，雙氫青蒿素哌喹片中雙氫青蒿素含量的數(shù)學(xué)表達(dá)式為:

式中，X為雙氫青蒿素哌喹片中雙氫青蒿素的含量(mg/片)為HPLC法的校正因子(mg/mL)，AX為供試品溶液中雙氫青蒿素的峰面積，VX為供試品溶液的體積(mL)為平均片重(g/片)，mX為供試品重(g)。

2.2 不確定度分量的評(píng)定

2.2.1 HPLC 法校正因子f的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(f)

2.2.1.1 對(duì)照溶液濃度的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(CS)

(1)對(duì)照品稱量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(mS)。主要來自天平精度的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u1(mS)和天平稱量重復(fù)性的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u2(mS)。

①天平精度的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u1(mS)。從天平校準(zhǔn)證書查得，所用量程范圍內(nèi)天平的精度為0.01 mg。按矩形分布計(jì)算，取包含因子則。

②天平稱量重復(fù)性的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u2(mS)。從天平校準(zhǔn)證書查得，所用天平的重復(fù)性(標(biāo)準(zhǔn)偏差)為0.02 mg，則 u2(mS)=s(mS)=2 × 10-2mg。

因?qū)φ杖芤汉瑢?duì)照品20.93 mg，故對(duì)照品稱量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:

(2)對(duì)照品純度的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(P)。由于雙氫青蒿素對(duì)照品的純度為100.0%，即分散區(qū)間半寬a=0.05%，純度p=0.999 5±0.000 5。按矩形分布計(jì)算，取包含因子則對(duì)照品純度的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:

(3)對(duì)照溶液體積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(VS)。主要來自量瓶體積的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u1(VS)、定容重復(fù)性的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u2(VS)和溶液溫度與量瓶校正溫度不同引起的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u3(VS)。

① 量瓶體積的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u1(VS)。查表［2］得，A級(jí)25 mL量瓶的最大允許誤差MPE為 ±0.03 mL。按矩形分布計(jì)算，取包含因子，則 u(V)

②定容重復(fù)性的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u2(VS)。將A級(jí)25 mL量瓶用溶液定容，精密稱定，重復(fù)操作10次，則標(biāo)準(zhǔn)偏差 s(VS)=0.01 mL，故 u2(VS)=s(VS)=0.01 mL。

③溶液溫度與量瓶校正溫度不同引起的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u3(VS)。溶液溫度Tt=26℃，量瓶校正溫度T0=20℃，查得甲醇和玻璃的體積膨脹系數(shù)分別為α醇=1.19 ×10-3和α玻=1.5 ×10-5，故25 mL量瓶因溫度不同產(chǎn)生的體積變化［2］ΔV=(α醇-α玻)× V20×(Tt-T0)=(1.19 × 10-3-1.5 × 10-5)× 25 ×(26-20)=0.18 mL。按矩形分布計(jì)算，取包含因子，則

故對(duì)照溶液體積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:

因此，對(duì)照溶液濃度的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:

2.2.1.2 對(duì)照溶液色譜峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(AS)

對(duì)照溶液連續(xù)進(jìn)樣10 次，測(cè)得峰面積為:251 638，250 540，249 386，251 880，252 519，251 173，248 497，250 321，251 707，250 892。計(jì)算得，均值為250 855，標(biāo)準(zhǔn)偏差 s(AS)=1 219，則 u(AS)=s(AS)=1 219。

測(cè)定校正因子f時(shí)，對(duì)照溶液平行進(jìn)樣6次，測(cè)得峰面積為:253 656，253 483，251 628，251 880，252 519和251 707。故對(duì)照溶液色譜峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:

2.2.2 供試品溶液色譜峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(AX)

供試品溶液平行進(jìn)樣2次，測(cè)得峰面積為243 799和241 057，均值A(chǔ)X=242 428，極差R=2 742。當(dāng)平行測(cè)定次數(shù) n=2時(shí)，查得［7］極差系數(shù) C=1.13，則=2.4 ×103，故供試品溶液色譜峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:

2.2.3 供試品溶液體積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(VX)

供試品溶液的體積為25 mL。按“2.2.1.1對(duì)照溶液體積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(VS)”項(xiàng)下計(jì)算，供試品溶液體積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:

2.2.4 供試品稱量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(mX)

供試品溶液中，供試品重0.265 1 g。按“2.2.1.1對(duì)照品稱量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(mS)”項(xiàng)下計(jì)算，供試品稱量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:

按“2.2.1.1天平精度的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u1(mS)”項(xiàng)下計(jì)算=5.8 × 10-3mg。

按“2.2.1.1稱量重復(fù)性的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u2(mS)”項(xiàng)下計(jì)算)=2 × 10-2mg。

根據(jù)中國(guó)藥典(2010年版)二部附錄ⅠA片劑重量差異檢查法［6］，取供試品20片，精密稱定，每片的重量分別為 0.530 3，0.530 7，0.532 8，0.526 4，0.529 7，0.530 4，0.534 1，0.527 3，0.528 3，0.531 4，0.528 0，0.527 3，0.535 9，0.529 7，0.532 4，0.534 1，0.529 9，0.531 4，0.526 3 g 和0.5264 g。計(jì)算得，平均片重0.530 1 g，標(biāo)準(zhǔn)偏差=2.7 mg，則片重差異的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為［8］:

因此，供試品平均片重的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:

2.3 合成不確定度的評(píng)定

根據(jù)式(2)，供試品中雙氫青蒿素含量測(cè)定的相對(duì)合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:

因?yàn)殡p氫青蒿素含量測(cè)定結(jié)果X=40.1 mg，故合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:

2.4 擴(kuò)展不確定度的評(píng)定

按95%置信概率，取包含因子k=2，實(shí)驗(yàn)擴(kuò)展不確定度為:

3 結(jié)論

根據(jù)以上不確定度的評(píng)估計(jì)算，雙氫青蒿素哌喹片中雙氫青蒿素的含量測(cè)定結(jié)果可表示為X±U，即40.1 mg ± 0.8 mg。

HPLC法測(cè)定供試品中雙氫青蒿素含量的不確定度分量及其權(quán)重見表1。

表1 不確定度分量及其權(quán)重

從表1可看出，HPLC法測(cè)定雙氫青蒿素哌喹片中雙氫青蒿素含量的不確定度由彼此獨(dú)立的、m和mX的不確定度分量構(gòu)成。其中，供試品溶液色譜峰面積AX所引起的不確定度分量對(duì)合成不確定度影響最大。

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