史清海，韓茹，伏建峰，魏靜，葛迪，冉繼華，劉正祥

人員急進(jìn)高原導(dǎo)致的急性缺氧性腦損傷表現(xiàn) 為感知能力、學(xué)習(xí)與記憶能力等大腦認(rèn)知能力下降，以及對(duì)動(dòng)作的協(xié)調(diào)性、準(zhǔn)確性的影響[1-2]。研究表明，急性低壓、低氧可導(dǎo)致大鼠大腦海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡，并最終導(dǎo)致大鼠學(xué)習(xí)與記憶等認(rèn)知能力下降[3-4]。細(xì)胞凋亡是由特定基因調(diào)控的，Bcl-2家族在細(xì)胞凋亡過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，其中Bcl-2和Bax被認(rèn)為是抑制和促進(jìn)細(xì)胞凋亡最重要的調(diào)控基因。石杉?jí)A甲(huperzine A)能增強(qiáng)中樞膽堿能神經(jīng)功能，臨床用于改善老年癡呆患者的健忘癥狀，除此之外還能提高神經(jīng)元抗氧化、抗興奮性氨基酸毒性等作用[5]。盡管石杉?jí)A甲在病理?xiàng)l件下能夠發(fā)揮多種作用，但其在急性低壓、低氧環(huán)境下對(duì)大腦海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的影響仍不明確。本研究通過(guò)觀察石杉?jí)A甲對(duì)急性低壓、低氧模型大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡及凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2和Bax表達(dá)的影響，探討石杉?jí)A甲對(duì)急性低壓、低氧模型大鼠的神經(jīng)保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 FLYDWC-IA型低壓氧動(dòng)物實(shí)驗(yàn)艙(中航工業(yè)公司)，Morris水迷宮MT-200(成都泰盟)，Nikon80i熒光顯微鏡(日本尼康)，雙垂直電泳儀DG-24DN、半干電轉(zhuǎn)膜儀DYCZ-40C(北京六一儀器廠)，熒光細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(Promega DeadEnd? Fluorometric TUNEL System)、Bax兔多抗IgG(SC-526)、Bcl-2兔多抗IgG(SC-783)、GAPDH(FL-335)兔多抗IgG(SC-25778)及Goat antirabbit IgG-HRP(SC-2004)均為美國(guó)Santa Cruz公司產(chǎn)品，ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(美國(guó)Pierce SuperSignal?)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及給藥 健康雄性SD大鼠48只(購(gòu)于新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)，體重240～280g，隨機(jī)均分為4組：平原組(對(duì)照組)、平原給藥組、高海拔組(模擬6000m海拔)、高海拔給藥組。石杉?jí)A甲片劑(批號(hào)100401，規(guī)格50μg/片)由河南竹林眾生制藥股份有限公司提供。將藥片研磨粉碎，加入適量雙蒸水配制成混懸液(10mg/ml)備用。平原給藥組和高海拔給藥組大鼠在正式模擬低壓、低氧實(shí)驗(yàn)前1d，按照0.1mg/kg體重劑量灌胃給藥，直到模擬急性低壓、低氧飼養(yǎng)結(jié)束為止。

1.3 模擬急性低壓、低氧飼養(yǎng)條件 將模擬低壓、低氧組大鼠置于高原環(huán)境模擬艙內(nèi)，以40m/s的速度分別升至6000m，氣壓穩(wěn)定在354±2mmHg，24h自然晝夜交替，并不間斷地以5.5L/min的速度注入新鮮空氣以提供飼養(yǎng)動(dòng)物所需氧氣，同時(shí)排出二氧化碳，艙內(nèi)溫度維持在24±2℃，濕度30%～40%，大鼠自由進(jìn)食水。高海拔組和高海拔給藥組連續(xù)低壓、低氧飼養(yǎng)7d，期間每天減壓給藥1次，隨后立即放回模擬艙。模擬急性低壓、低氧飼養(yǎng)結(jié)束后，4組大鼠分為兩部分分別進(jìn)行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)和海馬組織病理及凋亡因子檢測(cè)。

1.4 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn) 模擬急性低壓、低氧飼養(yǎng)7d后，4個(gè)實(shí)驗(yàn)組每組隨機(jī)選取6只大鼠(共計(jì)24只)進(jìn)行水迷宮實(shí)驗(yàn)，測(cè)試方法如下。①定位導(dǎo)航測(cè)試：用于檢測(cè)大鼠對(duì)水迷宮學(xué)習(xí)記憶的獲取能力。每天訓(xùn)練4次，分別從4個(gè)不同的入水點(diǎn)將大鼠面向池壁放入水中，平臺(tái)總位于對(duì)側(cè)象限，如果大鼠在60s內(nèi)未找到平臺(tái)，則逃避潛伏期記為60s，需將其引至平臺(tái)，大鼠站立于平臺(tái)10s后，將大鼠從平臺(tái)上取下來(lái)休息60s，按順序由下一象限入水進(jìn)行下一次實(shí)驗(yàn)。觀察并記錄5d訓(xùn)練期間大鼠每次尋找平臺(tái)所需的逃避潛伏期(s)。②空間探索實(shí)驗(yàn)：用于檢測(cè)大鼠學(xué)會(huì)尋找平臺(tái)后，對(duì)平臺(tái)空間位置記憶的保持能力。第5天定位導(dǎo)航測(cè)試完畢后，撤除平臺(tái)，選擇第3象限池壁中點(diǎn)作為入水點(diǎn)，將大鼠面向池壁放入水中，測(cè)試其在60s內(nèi)跨過(guò)目標(biāo)象限平臺(tái)，即原平臺(tái)相應(yīng)位置的次數(shù)(次)和原平臺(tái)所在象限滯留時(shí)間(s)[6]。

1.5 TUNEL法檢測(cè)海馬神經(jīng)元凋亡情況 模擬急性低壓、低氧飼養(yǎng)7d后，4個(gè)實(shí)驗(yàn)組剩余大鼠(未進(jìn)行水迷宮實(shí)驗(yàn)的大鼠)共計(jì)24只，用1%戊巴比妥鈉(40mg/kg)腹腔注射麻醉，開胸暴露心臟，4℃生理鹽水100ml心臟灌注，繼續(xù)用4%多聚甲醛PBS液(4℃，pH7.4)300ml灌注內(nèi)固定，待大鼠四肢及肝臟等發(fā)白變硬后迅速斷頭取出腦組織并完全分離出海馬組織。每只大鼠一半海馬組織置于4%多聚甲醛/25%蔗糖溶液(4℃)固定過(guò)夜，另一半進(jìn)行腦組織勻漿處理。海馬組織石蠟包埋，冠狀連續(xù)切片(5μm)，以TUNEL法原位檢測(cè)各組大鼠海馬CA1區(qū)凋亡細(xì)胞，操作過(guò)程嚴(yán)格按照TUNEL檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行，熒光顯微鏡觀察，TUNEL染色陽(yáng)性細(xì)胞可見(jiàn)細(xì)胞呈亮綠色熒光。每只大鼠取5張切片，在400×顯微鏡下重點(diǎn)觀察海馬CA1區(qū)，采用顯微圖像分析系統(tǒng)采集圖像，每張切片隨機(jī)計(jì)數(shù)5個(gè)視野，記錄單位視野中的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，取其平均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.6 海馬組織中Bcl-2、Bax蛋白的表達(dá) 海馬組織稱重后剪切成細(xì)小碎片，置于1ml勻漿器球狀部位，按照每20mg組織加入200μl裂解液的比例加入裂解液[50mmol/L Tris(pH7.5)、150mmol/L NaCl、1mmol/L PMSF、1μg/ml Aprotinin、1μg/ml Leupeptin、1%NP-40、0.5%脫氧膽酸鈉]，冰上上下移動(dòng)勻漿棒至勻漿液均一，置冰上裂解30min，用移液器移至1.5ml離心管中，4℃、12 000r/min離心10min，取上清分裝于0.5ml離心管中并置于－20℃保存?zhèn)溆?。BCA法檢測(cè)上清中蛋白質(zhì)濃度。100℃變性10min，上樣量20μg，12% SDS-PAGE分離后轉(zhuǎn)膜；5%脫脂奶粉常溫封閉2h，TBST洗滌3次，分別與1:1000稀釋的Bax、Bcl-2及GAPDH抗體反應(yīng)；室溫培育1h，洗滌3次，再加入1:5000稀釋的二抗，室溫培育1h，洗滌3次；ECL化學(xué)發(fā)光顯色，X線膠片曝光，顯影，定影，Gel-Pro Analyzer 4.0軟件進(jìn)行灰度分析。以兔抗鼠GAPDH作為內(nèi)參。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)以表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用q檢驗(yàn)(SNK)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn) 在定位導(dǎo)航實(shí)驗(yàn)中，各組大鼠逃避潛伏期隨訓(xùn)練時(shí)間推移逐漸縮短，但在每一時(shí)間點(diǎn)，高海拔組大鼠的逃避潛伏期均較平原組延長(zhǎng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，即需要花費(fèi)更長(zhǎng)時(shí)間才能找到平臺(tái)。而與高海拔組相比，每一時(shí)間點(diǎn)高海拔給藥組大鼠的逃避潛伏期均縮短(P＜0.05)，與平原組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05，圖1)。在空間探索實(shí)驗(yàn)中，與平原組相比，高海拔組大鼠60s內(nèi)穿越平臺(tái)次數(shù)和目標(biāo)象限滯留時(shí)間明顯減少(P＜0.05)。與高海拔組相比，高海拔給藥組60s內(nèi)穿越平臺(tái)次數(shù)明顯增多(P＜0.05)，目標(biāo)象限滯留時(shí)間明顯延長(zhǎng)(P＜0.05)，與平原組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05，圖2、3)。

2.2 海馬組織細(xì)胞凋亡計(jì)數(shù) 與平原組相比，高海拔及高海拔給藥組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡數(shù)量均明顯增加(P＜0.05)。而與高海拔組相比，高海拔給藥組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡數(shù)量明顯減少(P＜0.05)。平原給藥組與平原組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05，圖4)。

2.3 海馬組織細(xì)胞凋亡因子及抗凋亡因子表達(dá) 與平原組相比，高海拔組大鼠海馬組織中促凋亡因子Bax的表達(dá)明顯增加(P＜0.05)，抗凋亡因子Bcl-2表達(dá)明顯降低(P＜0.05)。與高海拔組相比，高海拔給藥組大鼠海馬組織中Bax表達(dá)降低(P＜0.05)，Bcl-2表達(dá)增高(P＜0.05)。平原給藥組與平原組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05，圖5)。

圖1 各組大鼠找到平臺(tái)所用時(shí)間(逃避潛伏期)變化Fig.1 Changes of time reaching the target platform (escape latency) in experimental rats

圖2 各組大鼠60s內(nèi)穿越平臺(tái)次數(shù)Fig.2 Times of crossing the former platform of rats within 60s

圖3 各組大鼠目標(biāo)象限滯留時(shí)間Fig.3 Time spent in the target quadrant of rats

圖4 大鼠海馬CA1區(qū)凋亡細(xì)胞計(jì)數(shù)Fig.4 Number of apoptotic cells in CA1 region of rat's hippocampus

3 討 論

高原環(huán)境具有低氣壓、低氧、高寒等特征，會(huì)對(duì)人體生理狀況產(chǎn)生嚴(yán)重影響[7-9]，行為學(xué)測(cè)試已證實(shí)，急進(jìn)高原人群智力、學(xué)習(xí)、記憶尤其是瞬時(shí)記憶和短時(shí)記憶等認(rèn)知功能均受到明顯損害[10-11]，但是這種大腦認(rèn)知功能損害的機(jī)制目前尚不清楚。石杉?jí)A甲是從中藥千層塔中提取的一種生物堿，臨床用于改善老年癡呆患者的健忘癥狀[5-7,10,12]，此外它在提高神經(jīng)細(xì)胞抗氧化活性、抗細(xì)胞凋亡及興奮性氨基酸毒性等作用方面也有報(bào)道[13]。但石杉?jí)A甲在急性低壓、低氧環(huán)境下對(duì)大腦海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的影響仍不明確。

圖5 Western blotting檢測(cè)大鼠海馬組織中Bax、Bcl-2蛋白的表達(dá)Fig.5 Expression of Bax and Bcl-2 in rat's hippocampus tissue

本研究模擬急性低壓、低氧應(yīng)激誘導(dǎo)大鼠急性高原損傷，Morris水迷宮測(cè)試結(jié)果顯示，經(jīng)石杉?jí)A甲給藥后，大鼠逃避潛伏期明顯縮短，60s內(nèi)穿越平臺(tái)次數(shù)明顯增多，目標(biāo)象限滯留時(shí)間明顯延長(zhǎng)，表明石杉?jí)A甲能夠改善模型大鼠的空間學(xué)習(xí)與記憶能力；TUNEL法原位檢測(cè)及Western blotting結(jié)果顯示，經(jīng)石杉?jí)A甲給藥后，大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡數(shù)量明顯減少，海馬組織中促凋亡因子Bax表達(dá)明顯降低，抗凋亡因子Bcl-2表達(dá)明顯升高，表明石杉?jí)A甲能夠提高模型大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞對(duì)抗細(xì)胞凋亡，降低細(xì)胞凋亡水平。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，石杉?jí)A甲對(duì)急性低壓、低氧導(dǎo)致的大鼠大腦海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡具有緩解作用，同時(shí)還可改善模型大鼠的空間學(xué)習(xí)與記憶能力。

高原環(huán)境對(duì)人腦的認(rèn)知損傷現(xiàn)象是客觀存在的，必須研究有效、可靠的認(rèn)知增強(qiáng)藥物，以緩解惡劣環(huán)境對(duì)大腦認(rèn)知功能的損傷。本研究評(píng)價(jià)的藥物石杉?jí)A甲在動(dòng)物模型中獲得了良好效果，具有良好的應(yīng)用價(jià)值，值得進(jìn)一步深入研究。

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