張巍， 趙行宇，李妍，徐俊杰，姜艷霞，呂士杰

核桃楸是具有治療作用的稀有樹木類物種之一，在亞洲和歐洲，其葉、根及種子是治療癌癥的傳統(tǒng)藥物[1]。胡桃醌(juglone)又名5-羥基-1, 4-萘醌，是一種天然環(huán)狀醌類，可從胡桃楸的葉及外殼中提取。研究發(fā)現(xiàn)胡桃醌在體外具有抗多種腫瘤細(xì)胞(包括人結(jié)腸癌細(xì)胞和人淋巴瘤細(xì)胞)的活性[2-3]。本研究對不同濃度胡桃醌在人宮頸癌HeLa細(xì)胞系的生長和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡中的作用進(jìn)行觀察，并探討其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要材料 胡桃醌、MTT、二甲基亞砜(DMSO)、碘化丙啶(PI)購自Sigma公司，Caspase-3分光光度法檢測試劑盒購自南京凱基公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及形態(tài)學(xué)觀察 人宮頸癌HeLa細(xì)胞系由本院實(shí)驗(yàn)室保存。細(xì)胞置于RPMI 1640完全培養(yǎng)基中，在37℃、5%CO2、95%濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞單層貼壁生長，每2d更換1次培養(yǎng)基，每周按1:3傳代。于倒置顯微鏡(日本Olympus)下觀察不同濃度胡桃醌對HeLa細(xì)胞生長速度、細(xì)胞形態(tài)以及懸浮細(xì)胞比例的影響。

1.3 MTT法檢測細(xì)胞增殖情況 取對數(shù)生長期HeLa細(xì)胞，培養(yǎng)24h后，去上清，將細(xì)胞分成正常對照組及10、20、50、100、200μmol/L濃度實(shí)驗(yàn)組。各組均采用DMEM培養(yǎng)基稀釋液培養(yǎng)24h，加入20μl MTT(5mg/ml)，37℃繼續(xù)孵育4h，棄上清，加入150μl DMSO振蕩10min，于570nm處測定吸光度(A)值。

1.4 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞生長周期 取對數(shù)生長期HeLa細(xì)胞，培養(yǎng)24h后去上清，分別加入10、20、50、100、200μmol/L胡桃醌，采用DMEM培養(yǎng)基稀釋液分別培養(yǎng)24h后，與空白對照組一起進(jìn)行胰酶消化，PBS洗滌細(xì)胞2次，15 000r/min離心10min(離心半徑10cm)，棄上清，4℃ 70%乙醇沉淀，PI避光染色30min，COUTLER流式細(xì)胞儀檢測，Listmode 2.0軟件分析細(xì)胞周期分布。

1.5 細(xì)胞Caspase-3活性檢測 各組取50μl含100～200μg蛋白的細(xì)胞或組織，采用細(xì)胞裂解液裂解，取上清加入50μl 2×Reaction Buffer，再加入5μl Caspase-3底物，37℃避光孵育4h。采用酶標(biāo)儀或分光光度計(jì)于405nm或400nm波長處測定其吸光度(A)值。

2 結(jié) 果

2.1 不同濃度胡桃醌對HeLa細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響不同濃度胡桃醌對HeLa細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響見圖1。對照組細(xì)胞緊貼瓶底，生長密集，細(xì)胞間連接緊密，呈有規(guī)則的多邊形，細(xì)胞觸角較短，圓形細(xì)胞少。經(jīng)10、20、50、100、200μmol/L濃度胡桃醌處理后，細(xì)胞附壁疏松，脫壁，形態(tài)變圓，且上述改變隨濃度增加更明顯。

圖1 不同濃度胡桃醌對HeLa細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響(×400)Fig.1 Effect of different concentrations of juglone on HeLa cell morphology (×400)

2.2 胡桃醌對HeLa細(xì)胞增殖的影響 不同濃度胡桃醌作用于HeLa細(xì)胞后，細(xì)胞生長受到不同程度抑制，與對照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05或P＜0.01)，且該抑制作用呈劑量依賴關(guān)系，隨著藥物濃度增加，抑制率升高(圖2)。

2.3 不同濃度胡桃醌對HeLa細(xì)胞周期的影響 正常生長的HeLa細(xì)胞G2/M期比例為7.50%。經(jīng)10、20、50、100、200μmol/L胡桃醌處理24h后，G2/M期細(xì)胞比例分別增加至12.92%、16.23%、23.64%、34.22%、52.64%(圖3)。

圖2 不同濃度胡桃醌對HeLa細(xì)胞增殖的影響Fig.2 Effect of different concentrations of juglone on Hela cell proliferation

圖3 不同濃度胡桃醌對HeLa細(xì)胞周期的影響Fig.3 Effect of different concentrations of juglone on HeLa cell cycle

2.4 不同濃度胡桃醌對HeLa細(xì)胞Capase-3活性的影響 不同濃度胡桃醌作用HeLa細(xì)胞24h后，Caspase-3活性顯著增加，且存在劑量依賴關(guān)系(圖4)。

圖4 不同濃度胡桃醌對HeLa細(xì)胞Caspase-3活性的影響Fig.4 Effect of different concentrations of juglone on the activity of Caspase-3

3 討 論

Pin1與腫瘤細(xì)胞的分化和增殖有關(guān)，是腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)的基因之一[4-5]。胡桃醌的抗腫瘤作用在國內(nèi)外均有報(bào)道，Chao等[6]及Paulsen等[7]認(rèn)為其能與Pin1催化域發(fā)生不可逆結(jié)合，從而抑制Pin1的活性。

Caspase家族在細(xì)胞凋亡過程中起著非常重要的作用，其中Caspase-3為關(guān)鍵的執(zhí)行分子，在凋亡信號傳導(dǎo)的許多途徑中發(fā)揮功能。正常情況下Caspase-3以酶原(32kD)形式存在于胞質(zhì)中，在凋亡的早期階段被激活，活化的Caspase-3由兩個大亞基(17kD)和兩個小亞基(12kD)組成，裂解相應(yīng)的胞質(zhì)胞核底物，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。在細(xì)胞凋亡晚期及死亡細(xì)胞中，Caspase-3活性明顯下降[8-11]。

本研究形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，不同濃度的胡桃醌均能使HeLa細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化，且MTT檢測顯示，不同濃度的胡桃醌均可明顯抑制HeLa細(xì)胞的增殖。進(jìn)一步對其凋亡情況進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示不同濃度胡桃醌均可將HeLa細(xì)胞周期阻滯于G2/M期，而Caspase-3活性檢測顯示胡桃醌可使Caspase-3活性增加，且具有劑量依賴性。

總之，本研究結(jié)果顯示，胡桃醌能誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞凋亡，有望成為繼傳統(tǒng)化療藥物之后的又一新型化療藥物，為抗腫瘤治療提供新的途徑。

[1]Inbaraj JJ, Chignell CF. Cytotoxic action of juglone and plumbagin: amechanistic study using HaCaT keratinocytes[J].Chem Res Toxicol, 2004, 17(1): 55-62.

[2]Paulsen MT, Ljungman M. The natural toxin juglone causes degradation of p53 and induces rapid H2AX phosphorylation and cell death in human fibroblasts[J]. Toxicol Appl Pharmacol,2005, 209(1): 1-9.

[3]Segura-Aguilar J, Jonsson K, Tidefelt U, et al. The cytotoxic effects of 5-OH-1,4-naphthoquinone and, 8-diOH-1,4-naphthoquinone on doxorubicinresistant human leukemia cells(HL-60)[J]. Leuk Res, 1992, 16(6/7): 631-637.

[4]Zhang CJ, Zhang ZH, Xu BL, et al. Recent advances in the study of Pin1 and its inhibitors[J]. Acta Pharmacol Sin, 2008, 43(1):9-17.

[5]Gu B, Ji QC, Zhao FZ, et al. Expressions of Pin1 and mTOR in esophageal squamous cell carcinoma tissue[J]. J Zhengzhou Univ (Med Sci), 2012, 47(2): 150-152. [谷博, 吉慶春, 趙富周,等. 食管鱗狀細(xì)胞癌組織中Pin1 和mTOR蛋白的表達(dá)[J]. 鄭州大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版), 2012, 47(2): 150-152. ]

[6]Chao SH, Greenleaf AL, Price DH. Juglone, an inhibitor of the peptidyl-prolyl isomerase Pin1, also directly blocks transcription[J]. Nucleic Acids Res, 2001, 29(3): 767-773.

[7]Paulsen MT, Ljungman M. The natural toxin juglone causes degradation of p53 and induces rapid H2AX phospho-rylation and cell death in human fibroblasts[J]. Toxicol Appl Pharmacol,2005, 209(1): 1-9.

[8]Thornberry NA. Caspases: key mediators of apoptosis[J]. Chem Biol, 1998, 5(5): R97-R103.

[9]Zhao YH, Chen QH, Hua HY, et al. Effect of lithium chloride on proliferation, apoptosis and mRNA expressions of Fas and Caspase-3 in human osteosarcoma U2-OS cell[J]. J Zhengzhou Univ (Med Sci), 2012, 47(4): 502-505. [趙意華, 陳清漢, 華海嬰, 等. 氯化鋰對人骨肉瘤細(xì)胞U2-OS增殖、凋亡及Fas、Caspase-3 mRNA表達(dá)的影響[J]. 鄭州大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2012, 47(4): 502-505.]

[10]Zhan YP, Qin J, Sun SL. Effects of memantine on expression of Caspase-3 and MDA in rats afterischemia-reperfusion[J]. J Zhengzhou Univ (Med Sci), 2011, 46(5): 748-751. [趙彥坡, 秦潔, 孫石磊. 美金剛對大鼠腦缺血再灌注后Caspase-3 表達(dá)及丙二醛含量的影響[J]. 鄭州大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版), 2011, 46(5):748-751.]

[11]Jia QH, Yang XP, Hui L, et al. Effect of lead acetate on apoptosis of human renal mesangial cells and caspase-3 expression[J]. Med J Chin PLA, 2012, 37(6): 628-631. [賈慶華, 楊霄鵬, 惠玲, 等.醋酸鉛對人腎小球系膜細(xì)胞凋亡及Caspase-3表達(dá)的影響[J]. 解放軍醫(yī)學(xué)雜志, 2012, 37(6): 628-631.]